本试验旨在研究细胞因子Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞炎症及凋亡的影响。体外培养奶牛乳腺上皮细胞，添加0.1μg/mL的重组蛋白Chemerin处理细胞。Western blot技术分析炎症相关基因IL-1β和IL-6、凋亡关键基因Bax、Bcl-2和Caspase-3在翻译水平上的表达；免疫荧光染色技术检测细胞内促炎性介质ROS的含量；流式细胞术分析细胞凋亡率。结果显示Chemerin组的炎症蛋白IL-1β和IL-6的表达显著上调（P < 0.01）；细胞内ROS含量较对照组也显著增加（P < 0.01）。同时Chemerin组凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和Caspase-3明显上调（P < 0.05），细胞凋亡率也显著增加（P < 0.05）。这些结果初步表明Chemerin通过调控相关基因的表达诱导奶牛乳腺上皮细胞发生炎症反应和细胞凋亡，其具体机制有待进一步阐明。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言 1
1. 材料与方法 2
1.1 试剂 2
1.2 主要仪器 2
1.3 细胞培养和处理 3
1.4 免疫荧光染色 3
1.5 Western blot检测 3
1.6 ROS含量测定 4
1.7流式细胞术 4
1.8 统计分析 4
2. 结果与分析 4
2.1 奶牛乳腺上皮细胞鉴定 4
2.2 Chemerin对促炎性因子表达的影响 4
2.3 Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞促炎性介质ROS表达的影响 5
2.4 Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞凋亡率的影响 5
2.5 Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞凋亡关键基因表达的影响 6
3. 讨论 6
参考文献： 7
致 谢 9
Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞炎症及凋亡的影响
引言
前言
奶牛乳房炎是现代奶牛养殖业中最常见且多因素的生产疾病，可造成产乳量的减少和质量低下，还易 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
延长产后发情和妊娠时间，甚至使病牛失去生产性能，因此对奶牛养殖业造成巨大的经济损失[1]。奶牛乳房炎可根据乳房乳汁中有无肉眼可见变化分成两类，隐性乳房炎和临床型乳房炎。患有临床型乳房炎的奶牛乳汁呈淡黄色或淡红色，并且会出现凝块、絮片等杂质，同时奶牛乳房肿胀[2]，相比之下，隐性乳房炎因其乳汁乳房无明显异常状况，所以对奶牛养殖业的危害更大 [3]。造成奶牛乳房炎的因素有很多，例如湿热生存环境、营养不均衡的饲料配方、错误的挤奶方式和奶牛自身因素等，但主要原因是致病菌对机体的感染。目前国内外针对此问题的报道大多集中于抗生素添加的缓解作用，但抗生素的大量使用造成了药物残留及耐药性等诸多问题[4]，因此，应用于奶牛乳房炎治疗的各种生物制品和治疗方法应运而生，其中低分子蛋白细胞因子因其对乳腺免疫机能的独特调控作用被广泛关注[5]。乳腺上皮细胞由于其独特的合成和分泌生理功能，可以作为研究乳腺生物反应器的理想模型。因此，探索乳腺上皮细胞生物学功能对提高奶牛生产力具有重要意义。
炎症是机体免疫系统为维持或恢复组织完整性做出的协调反应[6]。乳房炎的发生往往会导致促炎性细胞因子分泌增加，同时嗜中性粒细胞也会迁移至感染部位[7]。炎性细胞因子协同作用能促进和放大对组织损伤效果并诱导炎性介质ROS分泌[8]。代谢产物ROS是各种炎症性疾病发生的关键机制，ROS的异常积累可导致细胞凋亡。炎性白细胞如巨噬细胞等在抵抗细胞侵袭中意义重大，然而聚集过多的白细胞导致白细胞活化失调将对炎性组织造成损伤[9]，为恢复细胞组织的正常将启动细胞凋亡程序。细胞凋亡是基因编码的程序性细胞死亡[10]，与个体发育、组织更新、自身免疫等密切相关[11]。因此探究炎症和细胞凋亡对于乳腺炎的研究意义重大。
Chemerin是一种具有明确免疫功能的细胞因子，2003年，Wittamer 等[12]通过纯化卵巢癌患者腹水检测到Chemerin，并证明Chemerin通过其受体CMKLR1促进未成熟的树突细胞和巨噬细胞趋化。近年来，国内外学者发现类风湿性关节炎[13]、多囊卵巢综合征[14]等患者血清中及牙周炎[15]患者唾液中Chemerin水平明显升高，在患急性重症胰腺炎大鼠[16]的研究中也得到了类似的结果。最近有研究还发现，Chemerin在高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠中促进卵巢卵泡的凋亡[17]。同样在小鼠心肌细胞中，Chemerin同样具有促凋亡的效果[18]。显然，上述所有的研究表明，Chemerin在发挥其生物学功能时与炎症和细胞凋亡密切相关。Suzuki 等人[19]在牛乳腺中发现了Chemerin的表达，并证实其有上调与脂肪酸合成、葡萄糖摄取和酪蛋白合成相关基因的作用，然而，迄今为止，Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞中炎症和细胞凋亡的影响在很大程度上是未知的。本试验拟通过Chemerin处理体外培养的奶牛乳腺上皮细胞以分析炎症反应以及细胞凋亡的变化，为完善乳腺疾病致病机制和丰富奶牛乳房炎防治方法提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试剂
Chemerin（2325CM025）购于R&D公司，用含有10gL1的牛血清白蛋白的PBS将其稀释成100 μgmL1母液，并过滤除菌，于20℃保存。DMEM/F12培养基购自Hyclone公司、胎牛血清（FBS）购于浙江天杭生物科技有限公司；抗体IL1β( A11370)、IL6(A0286)购于ABclonal（武汉）公司；Bax（5059921g）、Bcl2（127891AP）和GAPDH (104941AP)购自Proteintech公司；Caspase3（bs0081R）抗体购自Bioss公司；Cytokeratin 18（ab52459）购自Abcam公司；Annexin VFITC凋亡双染测定试剂盒（556547）购于美国BD公司；ROS（活性氧）检测试剂盒购买于南京建成生物研究所。
1.2 主要仪器

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