3环状RNA分子（Circular RNAs，circRNAs）是一种广泛存在于哺乳动物细胞中特殊的非编码RNA分子，是目前关于circRNAs的研究是RNA研究领域的热点之一。本课题组前期通过高通量测序筛选得到一个丝/苏氨酸蛋白激酶(serine-threoninekinase，Akt)基因外显子形成的一条circRNA，命名为Circ-AKT2。本研究通过PCR扩增得该circRNA全长，构建慢病毒重组表达载体，通过共转染和筛选成功获得过表达Circ-AKT2细胞系。利用此细胞系研究Circ-AKT2在流感病毒A/PR/8毒株侵袭过程中可能发挥的作用及调控机制，为流感病毒的防控提供了新的思路。
目录
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1材料 4
1.1.1细胞和试剂 4
1.1.2主要仪器 4
1.2实验方法 5
1.2.1细胞培养 5
1.2.1.1 HEK293T细胞培养 5
1.2.1.2 A549细胞培养 5
1.2.2 HA效价和TCID50的测定 5
1.2.2.1 HA效价测定 5
1.2.2.2 TCID50测定 5
1.2.3 A549细胞接A/PR/8（H1N1)毒株 5
1.2.4 RNA提取 5
1.2.5 RNA反转录 5
1.2.5.1 RNA产品用量
1.2.5.2 RNA反转录 5
1.2.6 circAKT2检测 6
1.2.6.1检测AKT可能存在的成环位点 6
1.2.6.2配制SYBR Green I实时定量PCR的反应体系 6
1.2.7过表达载体构建 6
1.2.7.1设计过表达载体构建引物 6
1.2.7.2 构建circAKT2慢病毒过表达载体 7
1.2.7.2.1 circAKT2全长扩增 7
1.2.7.2.2 DNA片段的纯化回收 7
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3回收产物连接PCDHciR载体 7
1.2.8质粒纯化提取 7
1.2.8.1选用抑制重组的菌株Stbl3制备感受态细胞 7
1.2.8.1.1配置溶液 7
1.2.8.1.2用氯化钙制备新鲜的Stbl3感受态细胞 8
1.2.8.2 将circAKT2慢病毒过表达载体进行转化 8
1.2.8.3通过PCR鉴定转化子并对阳性克隆测序 8
1.2.8.4去内毒素高纯度质粒抽提 8
1.2.9转染和收集病毒上清 9
1.2.10 转导靶细胞 9
1.2.11 荧光倒置显微镜观察细胞样品荧光 9
2 实验结果 9
2.1流感病毒A/PR8/34(H1N1)毒株的血凝价测定 9
2.2流感病毒A/PR8/34(H1N1)毒株TCID50的测定结果 10
2.3检测circAKT2在PR8感染后216h表达水平 10
2.4扩增circAKT2全长 10
2.5 PCDHcircAKT2过表达载体的构建及验证 10
2.6检测circAKT2过表达水平 11
2.7 CircAKT2293T及CircAKT2A549稳定细胞系构建及验证 11
3 讨论 12
致 谢 13
参考文献 13
过表达CircAKT2细胞系构建及 CircAKT2功能初步研究
金善宝实验班（动物生产类）专业学生 黄磊
指导教师 顾金燕
Overexpressing CircAKT2 cell line construction and Preliminary study on CircAKT2 function
Student majoring in Veterinary medicine Huang Lei
Tutor Gu Jinyan
Abstract：Circular RNAs (circRNAs) are a novel type of RNA that, unlike linear RNAs, form a covalently closed continuous loop and are highly represented in the eukaryotic transcriptome.The study of circRNAs has gradually become one of the most noticeable areas in the field of RNA biology.This study using previous highthroughput sequencing screen for a circRNA formed by exons of serine/threonine protein kinase(serinethreoninekinase,Akt)genes named CircAKT2.The fulllength circRNA was amplified by PCR.To construct lentiviral recombinant expression vector, the CircAKT2 cell line was successfully obtained by cotransfection and screeningdesigned primers.This cell line is used to investigate the possible role of CircAKT2 in the invasion of influenza virus A/PR/8 strain and its new regulation mechanism, and to provide a new approach for the control of influenza viruses.
Key words:CircAKT2; overexpressing cell line；influenza viruses
circRNAs是一种广泛存在于哺乳动物细胞中具有共价闭合环状结构的RNA分子，并没有线性RNA的5’端帽子和3’端polyA尾的结构[1]。20世纪70年代，circRNAs首次在RNA病毒中发现[2]，随后人们又在酵母的线粒体中发现了新的circRNAs[3]。1993年，研究人员在人类细胞中也发现了一些由外显子构成的circRNAs[4]。由于它们表达量低，曾被认为是侥幸形成的RNA分子或者是RNA异常剪接的产物，当时所确认的circRNAs数目也只有少数几种[511]，针对它们的研究并不深入。随着RNA测序技术和生物信息学的发展，最新的研究成果显示哺乳动物细胞中存在大量稳定且保守的circRNAs[12]。而对于circRNAs的产生，有研究者提出了两种模型：外显子跳跃模型（exon skipping）和直接反向剪接（direct backsplicing）模型[13]。目前的研究发现，circRNAs可以调节宿主基因表达，与RNA 结合蛋白相互作用调控翻译过程，发挥顺式转录调控作用[14]，甚至可以调控亲本基因的表达和可变剪接等过程[13]等。

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