1不定根是植物根系的重要组成部分，对不定根的研究也是植物发育生物学的重要组成部分。甲烷（CH4）作为一个新型的气体信号分子被发现在植物的逆境生理以及根形态建成中有着重要作用。过氧化氢（H2O2）是一种重要的耐逆信号分子，参与调控植物生长发育、胁迫响应和程序性死亡等重要的生理过程。虽然CH4和H2O2在植物根系中有一定的作用，但他们在不定根发生中的作用及联系却尚不清楚。本实验以黄瓜“露丰”为实验材料，旨在探究CH4和H2O2在黄瓜不定根发生过程中的相关作用。实验表明，与对照组相比，CH4能明显的诱导黄瓜不定根发生，但这一诱导作用能够被H2O2抑制剂DMTU抑制，暗示H2O2参与了甲烷诱导的黄瓜不定根发生。在不定根发生过程中CH4处理能够明显的提高黄瓜外植体中H2O2的含量，这也提示了H2O2作为下游信号分子参与CH4诱导的黄瓜不定根发生。分子生物学证据表明CH4能够提高不定根发生中的重要靶基因CsDNAJ-1、CsCDPK1/5、CsCDC6、CsAUX22B-like和 CsAUX22D-like表达水平。本实验通过运用药理学以及分子生物学的方法表明 H2O2可能作为CH4诱导黄瓜不定根发生的下游信号，并通过调控CsDNAJ-1、CsCDPK1/5、 CsCDC6、CsAUX22B-like和 CsAUX22D-like的基因表达来实现。
目录
引言
研究发现多种植物存在甲烷（CH4）释放的现象[1]。同样，最近研究表明CH4也是一个新的植物气体信号分子，参与了诸如调节黄瓜不定根的发生[2]等许多生理过程。另外，过氧化氢（H2O2）在植物中有着广泛的生物学效应。最近研究发现, H2O2能调节植物在逆境下的生理变化，提高植物抗逆性：外源施加H2O2能提高苦菜的耐盐性[3]；用H2O2浸种的油菜，其抗寒能力明显上升[4]；H2O2在万寿菊不定根的发生中也起到重要的促进作用[5]。
植物根系是植物的重要组成部分，包括主根、侧根和不定根三种。根系主要起到吸收水分和矿质营养的作用，除此之外植物根系还能发挥支撑和固定的功能[6]。不定根是在植物非根组织上形成的无固定生长部位和无正常时序的根组织，其结构与主根和侧根相似，都包含中柱鞘、内皮层、皮层和表皮等结构[7]。不定根发生是一个涉及到植物体内一系列信号变化的复杂过程[8]， *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
不定根起源于干细胞，经过一系列有细节差异的信号分子调控下的细胞分裂和分化，最终发育成不定根[9]。研究不定根发生中的信号转导机制对明确植物生长中的信号转导机制有着重要意义[10]。目前已发现多种信号分子在不定根发生中起调控作用，并且多种信号分子对不定根发生的诱导作用与调控靶基因转录水平有关[11]。CH4和H2O2已被分别证实对生长素诱导的黄瓜不定根发生具有促进作用，并且有研究表明且这一作用是通过调控不定根发生中几个关键基因：CsDNAJ1、CsCDPK1/5 、CsCDC6 、CsAUX22Blike和 CsAUX22Dlike的表达实现的[2][5]，但作为生长素的下游信号分子，两者在这一过程中是否存在相互作用目前并不明确。本研究以黄瓜“露丰”为研究材料，通过药理学以及分子生物学方法，主要研究和探讨了CH4和H2O2对生长素诱导的黄瓜不定根发生的影响，为进一步探究CH4和H2O2参与的复杂信号转导网络提供理论基础。
1．材料与方法
1．1 材料
1．1．1 化学试剂
除了特殊说明的试剂外，其他所有试剂均自Sigma（St Louis, MO, US A）公司购买。生长素极性运输阻断剂NPA [N1naphthylphtalamic acid]，采购自Chem Servive（West Chester, PA, USA）。NPA使用浓度为10 μM，H2O2使用浓度为1mM，H2O2抑制剂DMTU使用浓度为5 mM。其他试剂使用浓度根据具体实验中的试剂配套的说明书确定。试剂浓度的选择均经过预实验确定且具有显著生物学效应。
1．1．2甲烷水溶液制备
富甲烷水溶液（Methane rich water ,MRW）由南京特种气体厂有限公司购买的99.9% 纯度甲烷通过鼓泡法制得。具体方法如下：将甲烷气体以约160 mL/min的流速持续通入装有250 mL去离子水的容器中15 min，即得到饱和甲烷水溶液。制备好的饱和甲烷水溶液立即用去离子水稀释至80%，即为实验用MRW（该浓度经过预实验确定并具有显著生物学效应）。在本实验条件下，MRW中CH4浓度约为1.05 mM。
1．1．3黄瓜幼苗的培养
本实验使用的“露丰”黄瓜（Cucumis sativus ‘Lufeng’）种子由江苏省江蔬种苗科技有限公司提供。种子用5% 的次氯酸钠溶液消毒15 min，并用自来水冲洗约20 min至无异味。将黄瓜种子均匀摆放在铺有润湿滤纸的培养皿上，置于25 ℃暗处催芽，2 d后选取生长程度相近的幼苗移至光照培养箱（上海恒科技有限公司），在光周期 14 h / 10 h、光强度200 µmol m2s1、温度25 ℃条件下培养至子叶完全展开。黄瓜幼苗切除顶芽后，在NPA溶液中再培养48 h后可进行之后处理。
1．1．4 外植体处理
将经NPA预处理2d的黄瓜幼苗切除主根以得到黄瓜幼苗外植体。将黄瓜外植体放入含CH4、H2O2、DMTU单独或组合处理液的培养皿中，共计6种处理即：Con、CH4、H2O2、DMTU、H2O2+DMTU和CH4 +DMTU。每一个培养皿中放入10棵黄瓜外植体，每个培养皿装有15 mL处理液。将处理好的外植体放入光照培养箱中，在光周期14 h/10 h（光/暗）、光强度200 µmol m2 s1 、温度25 ℃下培养4d，不定时翻动黄瓜外植体，保证黄瓜下胚轴基部浸没于处理液中，观察表型并拍照记录，或根据需要在不同时间段切取外植体下胚轴基部（不定根发根部位[12]）约0.5 cm组织，进行后续研究。
1．2 不定根发生的表型分析
黄瓜外植体CH4、H2O2、DMTU单独或组合处理4 d后，观察测量其不定根数目和长度，对黄瓜外植体发生的不定根根长及根数进行拍照并记录。不满1 mm的不计入数据。
1．3内源H2O2含量变化的时间进程检测
1．3．1 H2O2分析试剂配置
400 mL H2O2分析试剂：
药品
浓度
400 mL溶液中实际加入的质量
硫酸亚铁铵
500 µM
0.078 g
硫酸
500 µM
1.961 g
二甲酚橙
200 µM
0.061 g
山梨醇

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