金属离子在植物体内的浓度动态平衡对植物的生长发育很重要，NRAMP基因家族参与金属离子转运并在离子稳态中发挥着重要作用。NRAMP在许多植物如水稻、拟南芥、大豆和小麦中均存在克隆，且具有广泛的底物范围，包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+等。本研究构建表达载体将AtNRAMP6基因转化到酵母突变株zrcl(Zn)，cup2(Cu)，pmr1(Mn)，ccc1(Fe)中，并进行金属毒性生长实验，发现AtNRAMP6在酵母中具有转运Fe离子的功能；构建AtNRAMP6的亚细胞定位载体，通过PEG介导法转化到拟南芥叶肉细胞原生质体中，对其AtNRAMP6进行亚细胞定位，发现AtNRAMP6-GFP表达载体主要在内膜系统上表达；通过荧光定量分析实验发现AtNRAMP6在地上部的表达量是地下部的27倍左右。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2酵母表达载体构建 3
1.2.1拟南芥RNA的提取3
1.2.2第一条链cDNA合成3
1.2.3PCR扩增基因编码区3
1.2.4琼脂糖凝胶电泳 4
1.2.5目的片段的纯化、回收4
1.2.6酵母表达载体的双酶切4
1.2.7载体及目的片段的连接5
1.2.8连接产物转化大肠杆菌5
1.2.9菌检PCR5
1.2.10重组表达质粒DNA的制备6
1.3表达载体转化酵母突变株6
1.3.1醋酸锂法转化酵母6
1.3.2酵母阳性克隆鉴定6
1.4金属毒性生长实验7
1.5亚细胞定位载体的构建 7
1.6 AtNRAMP6的亚细胞定位8
1.7qRTPCR检测AtNRAMP6表达量8
2结果与分析9
2.1酵母表达载体的构建9
2.2表达载体转化酵母突变株10
2.3金属毒性生长实验10
2.4亚细胞定位载体的构建11
2 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
.5AtNRAMP6的亚细胞定位12
2.6qRTPCR检测AtNRAMP6表达量12
3讨论 13
致谢14
参考文献14
关于金属转运蛋白AtNRAMP6功能的初步研究
引言
引言：金属阳离子对于植物营养是必不可少的。必需金属离子（如Fe2+、Mn2+、Cu2+等）作为酶促反应的必需辅助因子、蛋白质中结构离子等，其在植物体内的浓度动态平衡对植物的生长发育很重要。但重金属离子（如Pb2+、Cd2+、As3+等）的吸收会扰乱正常植物细胞中的代谢活动，甚至通过食物链对人类和动物的健康造成严重危害。许多研究表明，金属离子转运体可维持植物体内恰当的金属离子浓度，而在这些转运体中，NRAMP基因家族起着重要的作用。
在动物体内首先发现NRAMP基因家族（Natural resistance associated macrophage protein，天然抗性相关巨噬细胞蛋白）并被克隆。最初发现显性基因Bcg，Lsh或Ity负责小鼠细胞内寄生虫感染的抗性调节[1]，并命名为NRAMP基因[2]。之后，在植物中也陆续发现NRAMP基因家族同源物。
由对NRAMP基因家族的序列的结构分析可知其具有10~12个跨膜结构域，并在TM8和TM9之间有一个17氨基酸序列基元——“转运蛋白共有特征序列”，1~2个糖基化位点和1个离子转运域，属于膜整合转运蛋白家族，保守性很高[3]。其广泛存在于细菌、真菌、酵母、昆虫、高等植物以及哺乳动物中，具有广泛的底物范围，包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+等。目前植物NRAMP基因家族已被收录于植物基因组和植物数据库中，并且在分子水平上已有研究的各种植物中都含有来自这个家族的基因，如水稻[4]、拟南芥[5]、小麦[6]、大豆[7]、馒头柳[8]，遏蓝菜[9]等。在不同物种中，也存在NRAMP基因家族转运的金属离子类别和强度不完全相同的情况。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）中共有6个NRAMP基因，命名为AtNRAMP16。利用酵母Mn2+吸收缺陷型菌株进行酵母互补实验，发现了AtNRAMP1、AtNRAMP3、AtNRAMP4这三个基因编码的转运蛋白具有Mn2+转运活性，除此之外还具有Cd2+和Fe2+的转运活性[5]，但AtNRAMP1主要转运Mn2+，AtNRAMP3和AtNRAMP4主要转运Fe2+。拟南芥叶肉细胞的液泡能在拟南芥生长过程中储存锰，在Mn2+浓度低的情况下，液泡中的锰通过AtNRAMP1等被转出，以供叶肉细胞进行光合作用[10]。AtNRAMP2具有Cd2+和Mn2+转录活性[11] 。AtNRAMP6增加了对Cd2+的敏感度但不影响细胞内的Cd2+总量[12]。
在拟南芥植物体中，AtNRAMP1、AtNRAMP2优先在根中表达[11]。AtNRAMP3多在植物初生根、次生根的中轴及茎、叶的维管束中表达，且Fe2+浓度低时GUS的活性由于AtNRAMP3启动子的上调表达而增强，说明在植物体金属离子的长距离运输中AtNRAMP3可能发挥着作用。AtNRAMP4也优先在地上部位表达，而AtNRAMP5的组织定位位于生殖器官[13]。
拟南芥中AtNRAMP基因家族的细胞亚定位也不尽相同。AtNRAMP1定位于细胞质膜。AtNRAMP2在高尔基体外侧网络表达[14]。将GFP与AtNRAMP3融合并在拟南芥原生质体中进行瞬时表达研究，发现AtNRAMP3、4在细胞内均定位于液泡膜上，很可能负责金属离子在液泡内外的运输[5]。AtNRAMP6定位于细胞器膜上，但具体位于何种细胞器仍未得出结论。
为研究AtNRAMP6基因的金属离子吸收转运功能，本研究将外源的植物AtNRAMP6基因转入已敲除金属离子吸收转运功能相关基因的酵母中，进行金属毒性生长实验探究AtNRAMP6的转运金属底物；构建亚细胞定位载体，通过叶肉细胞原生质体的瞬时表达对AtNRAMP6基因表达产物进行亚细胞定位；利用荧光定量PCR比较AtNRAMP6基因在地上部和地下部的表达情况。通过对AtNRAMP6基因的研究，为揭示NRAMP基因在胞内转运金属离子的具体作用机制和开发耐重属胁迫的植物新品种打下坚实基础。

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