n乙酰转移酶的纯化及生理功能分析
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
一、材料与方法3
（一）实验材料3
1．菌株 3
2．培养基 3
3．酶和试剂 3
4.仪器3
（二）实验方法4
1.基因表达载体的构建4
（1）18525、18530基因引物设计4
（2）PCR扩增目的基因及扩增产物的纯化4
（3）基因及载体的酶切5
（4）载体与基因的连接与转化5
（5）重组质粒的鉴定5
2．蛋白质的检测表达、表达条件优化及纯化6
（1）蛋白质检测表达6
（2）蛋白质表达条件优化6
（3）蛋白质纯化6
3.药物敏感性实验7
二、结果7
（一）N乙酰转移酶基因表达载体的构建7
（二） N乙酰转移酶的表达7
（三）N乙酰转移酶表达条件的优化8
（四）N乙酰转移酶的纯化9
（五）药物敏感性实验11
三、讨论11
致谢12
参考文献12
N乙酰转移酶的纯化及生理功能分析
生物 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072*
学（基地班）学生 姚月朗
引言
一、粘质沙雷氏菌：
沙雷氏菌属（Serratia）细菌属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）革兰氏阴性、兼性厌氧型细菌。沙雷氏菌广泛分布于土壤、水等环境中，一些菌株是威胁人体健康的致病菌。[1]沙雷氏菌属主要包括普城沙雷氏茵(S.plumuthica)、变形沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）、深红沙雷氏菌（S. plymuthica）、粘质沙雷氏茵（Serratia marcescens）、臭味沙雷氏菌（Serratia aderifera）、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola）、液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）、虫媒沙雷氏菌(Serratia etomophila）、革氏沙雷氏菌(Serratia grimesii）和无花果沙雷巧菌（Serratia ficaria）等。粘质沙雷氏菌是该属的模式菌株[2] 。
粘质沙雷氏菌FS14是本实验室白术根腐病害样品中分离出的产灵菌红素的肠杆菌，其对于植物病害真菌具有很强的抑制作用。此外，粘质沙雷氏菌的几丁质酶可以被用于防治植物真菌病害、昆虫病害[3]。
二、N乙酰转移酶
N乙酰转移酶（General control nonrepressible 5 related（GCN5related）Nacetyltransferases, GNATs）在动植物，以及微生物体内广泛存在。
在真核生物中，有关于乙酰化的研究已经十分广。例如：N乙酰基转移酶2（Nacetyltransferase2，NAT2)，它是目前国际上倍受关注的代谢酶之一，负责催化乙酰基团从乙酰辅酶 A（乙酰CoA）转移到杂环胺类物质的乙酰化过程，在一些药物代谢以及致癌物质的灭活或活化过程中起着重要的作用。NAT2作为生物转化的第二相酶，其活性直接影响致癌物质在人体内的代谢和毒性反应的强弱[4]。
然而在原核生物中，近几年来它们才逐渐的进入人们的视野，这类酶主要通过乙酰辅酶A(acylcoenzyme A, AcCoA)作用于底物，它们的底物范围很广，包括氨基糖苷类抗生素、多胺、芳烷基胺、葡糖胺6磷酸以及其他小分子物质[5]。例如：在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）内发现了35种N乙酰基转移酶，随着抗生素的使用，许多菌株表现出了抗药性，抗药性的产生可以源自多种途径，如：氨基糖酸酶类的修饰酶、核糖体突变等等。[6]
因此，了解粘质沙雷氏菌的N乙酰基转移酶的功能可以帮助我们更好的掌握它的生理生化特性，为其在工业领域及农业方面的应用探索更多的可能。
一、材料与方法：
（一）实验材料：
1.菌株
粘质沙雷氏菌FS14、大肠杆菌DH5α，大肠杆菌C43（DE3）
2.培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，pH 7.0。
3.酶和试剂
限制性内切酶NdeI，XhoI购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶和pfu购自Thermo公司DNA凝胶回收试剂盒购自北京鼎国昌盛生物有限公司；IPTG来自Merck公司；酵母提取物、胰蛋白胨、丙烯酰胺和SDS来自上海生物工程有限公司；氨苄抗生素来自南京基天生物技术有限公司；其他常规试剂使用国产分析纯级或进口分装。
4.仪器
PCR扩増仪 (Applied Biosystems，2720 ThermalCycler，购自基因有限公司)
水平式核酸电泳槽 (DYCP31BN，买自北京市六一仪器厂)
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/swgc/67222.html
