黏附相关蛋白alp609在蜜蜂螺原体侵染宿主细胞过程中的作用研究
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 菌株与蜜蜂2
1.2培养基 2
1.3 主要试剂及配制2
1.4仪器3
1.5 实验技术及方法3
1.5.1 黏附蛋白的表达与纯化3
1.5.2黏附蛋白的除盐与浓缩4
1.5.3考马斯亮蓝法测定蛋白含量4
1.5.4意蜂中肠细胞的分离培养 4
1.5.5 黏附蛋白在侵染过程中的作用5
1.5.5.1竞争结合实验 5
1.5.5.2 抗体抑制实验 5
2 结果与分析 5
2.1 螺原体黏附蛋白的表达与纯化5
2.2黏附蛋白含量的测定6
2.3 意蜂中肠细胞的分离与培养6
2.4 黏附蛋白在螺原体侵染宿主细胞过程中的作用 7
2.4.1 竞争结合实验 7
2.4.2 抗体抑制实验 7
3 讨论 8
致谢... 8
参考文献 8
黏附相关蛋白ALP609在蜜蜂螺原体侵染宿主细胞过程中
的作用研究
引言
螺原体是一类非常特殊的微生物，最早发现 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072*
于上世纪七十年代[1]。螺原体和宿主之间的关系可分为共生(mutualism)、互生(commensalism)和致病(pathogenicity) 3 种，多数螺原体与宿主的关系为共生或互生[2]。其宿主主要为植物[3]、昆虫和水生甲壳动物[4]，也有部分螺原体分离自哺乳动物[5]。螺原体一般有以下几个主要特征：（1）体积小，可滤过0.22 μm 的微孔滤膜；（2）无细胞壁，细胞膜具有三层结构，由蛋白质和脂质组成[6], 位于菌体的最外层作为屏障；（3）形态具有多样性，在对数期呈现螺旋形，而在平台期和衰亡期呈现球形、哑铃型和蝌蚪型等不规则形态[7]；（4）具有运动性[8]，可在人工培养基中培养[9]；（5）基因组小，G+C含量低。基因组大小在7802200 kbp，G+C含量在26%左右。
螺原体缺少细胞壁，其细胞膜在侵染宿主的过程中扮演了重要的角色。螺原体的传播包括对宿主细胞的黏附和侵入两个过程。螺原体上的黏附蛋白与宿主细胞表面的受体蛋白识别互作是侵染过程中的第一步，这一过程涉及到一些黏附相关膜蛋白 （adhesionrelated protein）。体内及体外实验均证明，螺原体的三个膜蛋白即脂蛋白螺旋素(spiralin)、黏附相关蛋白(ScARP3d)及磷酸甘油酸激酶(PGK)与昆虫细胞有直接联系[10]。
螺旋素是螺原体属特有的两性脂蛋白[11]，也是目前研究最为透彻的一种柑橘螺原体(S. citri) 膜蛋白。螺旋素在螺原体传播过程中起到重要作用，它促进螺原体黏附到肠上皮细胞或者昆虫载体唾液腺。Castano等提出一种模型：螺旋素形成一个“蛋白毯”覆盖在整个螺原体的表面[12]，这种结构可以保证螺原体的高效率传播[11,13]。S. citri GII3的spiralin可以作为凝集素在体外与C. haematoceps 的两种糖蛋白相结合。因此，它可能作为一种配体蛋白与昆虫表面的受体蛋白相结合[14]。Nathalie Arricau Bouvery等人通过激光共聚焦免疫显微镜观察到螺原体粘附区域的螺旋素发生“移位”，使用凝集素进行竞争实验表明螺旋素表现出复合糖结合的特性，推断螺旋素通过一种“凝集素复合糖”相结合的方式促进螺原体的黏附[10]。
研究表明当柑橘螺原体突变缺失5个质粒pScil5（编码8个粘附相关因子，ScARPs）后，其粘附宿主细胞的能力减弱[15]。螺原体粘附相关因子的基因序列与支原体粘附因子P40的基因序列有极高的相似度，P40在支原体黏附宿主细胞时辅助粘附蛋白锚定在黏附细胞器的细胞骨架中，并且黏附因子P40与其他三个黏附因子P1、P30和P90串联所形成的复合物是受体识别所必须的[16]。
本课题研究对象为蜜蜂螺原体Spiroplama melliferum CH1菌株，由陈永萱教授于1988年从患“爬蜂病”的蜜蜂体内分离得到[17]。S. melliferum CH1 可以造成蜜蜂“爬蜂病”，这严重制约了我国蜜蜂行业的发展。螺原体黏附到宿主细胞是螺原体侵染宿主的关键环节，研究黏附蛋白在侵染过程的功能，不仅对螺原体的防控至关重要，而且可以为了解其致病机理提供依据。
1 材料与方法
1．1 菌株和蜜蜂
试验菌株为本实验室已构建好的表达ALP609蛋白的大肠杆菌E. coli BL21 609菌株
蜜蜂为意大利蜜蜂Apis mellifera
1．2 培养基
（1）LB培养基（1 L）：
胰蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
氯化钠 10 g
琼脂（固体） 20 g
pH 7
（2）R2固体培养基（100 mL）：
PPLO肉汤 2 g
蔗糖 10 g
0.1%酚红 2 mL
血清 15 mL
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/swgc/65679.html
