二氧化碳的大量排放是造成温室效应的主要原因之一，近几年因其引发的一系列环境问题而受到广泛关注。由于土壤中固碳微生物具有碳同化能力强，分布广泛的特点而在研究全球土壤碳库，降低大气CO2等研究中逐渐被多方重视。本实验采取安徽省宣城市地区典型壤土、砂土及粘土作为研究材料，进行淹水及鸽粪添加室内培养试验，以cbbLR基因作为指示基因，建立cbbLR基因文库并进行固碳微生物群落多样性及其理化影响因素分析。结果表明，不同土壤类型中固碳细菌多样性规律为粘土≈壤土>砂土，但总体受鸽粪添加及淹水处理的干扰能力大小则呈现砂土>壤土>粘土的特征。通过群落组成分析鉴定样本中优势纲为α及β变形杆菌，优势属Rhodopseudomonas，Rubrivivax，Rhodobacter及Burkholderia。此外，对三种环境变量及理化因子对土壤cbbLR基因文库微生物多样性的影响进行量化分析表明土壤质地对携带cbbLR基因固碳微生物影响最大，其次是鸽粪添加和淹水处理；而有机质、pH及钾元素含量是影响cbbLR固碳菌群的主要因子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料及样品采集2
1.1.1 实验材料2
1.1.2 实验地点2
1.1.3 取样时期与取样方法2
1.2 土样培养 2
1.3 土壤理化性质测定3
1.4 功能基因cbbLR的PCR扩增3
1.5 cbbLR基因克隆文库的构建4
1.5.1 PCR产物的TA克隆4
1.5.2 感受态细胞的制备4
1.5.3 普通感受态细胞酶连产物的转化4
1.5.4 菌体PCR扩增挑选阳性克隆子5
1.6 cbbLR基因克隆文库的RFLP分析5
1.6.1 阳性克隆子PCR产物的限制性内切酶酶切5
1.6.2 酶切产物电泳分析6
1.7 cbbLR基因克隆文库统计分析 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
6
1.7.1 文库酶切类型归类分析6
1.7.2 群落结构多样性评价指数的计算方法6
1.7.3 序列测定7
2 结果与分析 7
2.1土壤固碳细菌cbbLR基因扩增及RFLP分型7
2.2 土壤固碳细菌群落（cbbLR基因）α多样性分析 8
2.3 土壤固碳细菌群落（cbbLR基因）β多样性分析 9
2.4 土壤固碳细菌群落组成分析 10
2.5 土壤固碳细菌群落多样性影响因素分析 11
3讨论 13
致谢14
参考文献15
 鸽粪添加及淹水条件对不同土壤固碳微生物多样性的影响
引言
近年来，温室效应对全球气候造成的影响引人关注。大气中CO2是造成温室效应的主要气体，其效应占总效应的50%左右[1]。为降低大气中CO2浓度，研究者开发了多种固定CO2的方法，主要分为物理、化学及生物方法。利用微生物固定CO2的生物途径因具有经济环保的特点而受到普遍的重视。固碳微生物是一类可以吸收无机碳并将其转化为有机物及自身细胞物质的微生物，作为环境适应能力极为强大的类群，固碳微生物在土壤，大气，海洋中皆有分布[2]。而由于农田中存在丰富的微生物类群且碳同化量巨大，因此对人为耕作农田土壤中固碳微生物的研究具有重大意义[3]。
固碳微生物可以根据获取能源的途径分为两大类[4]：光能自养微生物和化能自养微生物。其中光能自养微生物包括蓝细菌及藻类等，这类微生物细胞中一般包含一种或几种光合色素，利用光作为能源，以二氧化碳作为基本碳源，并利用某些还原态的无机化合物（例如H2O）作为供氢体还原二氧化碳；化能自养微生物包括硝化细菌、硫化细菌等，此类微生物以H2、H2S、NH4+、NO2、Fe2+等为主要能源，以CO2作为唯一或主要碳源，但生长较为缓慢。除此之外也存在自养与异养之间的过渡菌种，这类兼性自养微生物同时可以从环境中吸取少量小分子有机物作为碳源，由于其可依靠不同的营养过程，使其在复杂多变的自然环境中往往可以获得对环境的高度适应性。
目前已知固碳微生物同化CO2的途径有五条[5]，即卡尔文循环，还原性三羧酸途径，3羟基丙酸途径，琥珀酰辅酶A途径及厌氧乙酰辅酶A途径。已有研究表明，卡尔文循环是光能自养微生物及化能自养微生物同化CO2的主要途径。在这一途径中，其特征酶是核酮糖二磷酸羧化酶和磷酸核酮糖激酶。核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）为卡尔文循环中关键酶，对于碳同化的第一步起到催化作用。根据其特性RubisCO可被分为Ⅰ—Ⅳ型[6]，Watson[7]等按照氨基酸组成的进化类型将RubisCOⅠ分为“greenlike”和“redlike”两种类群。由于RubisCOⅠ大亚基部分编码基因cbbL具有高度保守性[8]，因此greenlike和redlike两个类群中的cbbLG和cbbLR基因被分别广泛应用于自养微生物固碳途径的研究[9]。Yuan[10]等的研究结果表明施用氮磷钾肥下的稻田土中cbbL基因拷贝数极大程度地提高，细菌总量有所增加，优势菌种及丰富度也有改变及提高。并通过对土壤成分的分析发现，PH、土壤有机碳含量以及RubisCO活性起到重要影响作用。简燕[11]等以稻田、水旱轮作及坡旱地三种不同耕作方式下的耕作层土壤为研究材料，发现稻田土中固碳微生物群落及功能性高于旱地，并且含有更丰富的兼性自养菌种群，而旱地中生境较稻田相比不适于兼性自养菌生长，细菌群落多样性较低，固碳能力也大为下降。
目前我们对固碳微生物的研究以海洋，湖泊及未受人类干扰的森林，草原等生态系统为主，受人为干扰频繁的农田土壤则研究较少。研究内容方面，对土壤固碳微生物的多样性、丰度研究较多，而研究多样性与丰度对不同生境及不同农田管理措施，不同土壤理化因子的响应研究较少。此外，人为农田管理措施诸如淹水（还原性条件下还原物质的大量生成提供自养微生物能源物质），有机肥添加（因有机质等营养物质的加入而促进土壤微生物群落多样性及丰度的改变）等条件对固碳微生物群落结构的影响并不清楚。基于以上考虑，本研究将以不同质地土壤在人为干扰因素下（如有机肥添加，稻田淹水环境等）的固碳微生物为对象，探究cbbLR固碳基因微生物的多样性及其主要生境及理化影响因素
1 材料与方法
1．1 实验材料和样品采集

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