2昆虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂常表现出调节机体免疫应答、参与凝血、抑制肿瘤细胞的增殖和迁移等方面的活性。但到目前为止，与马陆来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂的相关报道非常少。在本研究中，克隆了一个马陆来源的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin-YM），该丝氨酸蛋白酶抑制剂长为228bp，其中前19个氨基酸为信号肽。然后利用大肠杆菌原核表达系统成功表达出了一个27KD的融合蛋白，并利用镍离子亲和柱层析和透析进行纯化。最后对Serpin-YM的抑癌活性进行测定，发现Serpin-YM能够抑制HeLa细胞的增殖，并且在5μM时就表现出显著的抑制作用，Serpin-YM有潜力开发为癌症治疗药物。
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引言
1 引言
免疫系统主要是用于阻挠病原微生物的侵入以及维持机体稳态，由效应分子、细胞和组织构成。在限制病原微生物进入到宿主体内方面，主要是宿主自身产生的蛋白酶抑制剂在发挥作用。作为机体免疫系统的重要组成部分，蛋白酶抑制剂与其相应的蛋白酶在生物体内形成一个动态的系统，调控着机体的一系列生理作用并且维持着机体的稳态 [1,2]。
蛋白酶抑制剂（PIs）是广泛存在于各种生物体内的一类蛋白或多肽，能抑制蛋白酶水解酶的催化活性，在维持机体稳态以及各种生理活动中发挥十分重要的作用[3]。蛋白酶抑制剂根据其活性位点的氨基酸种类的不同主要分为四大类型：丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂[4]。在两栖类动物中，蛋白酶抑制活性一般存在于其皮肤分泌物中，且其中一些蛋白酶抑制剂已经从两栖类动物的皮肤中鉴定并分离出来，如从铃蟾属类的皮肤分泌液中得到了胰蛋白酶抑制剂、从华西蟾蛛的皮肤分泌物得到了丝氨酸蛋白酶抑制剂[5]。
丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类研究最为广泛的蛋白酶抑制剂家族，有18个不同的家族[6]，如kunitz, kazal, serpin, TAP以及TIL家族等，可以通过其自身的变构作用抑制丝氨酸蛋白酶水解活性[7]。现从动物、病毒、植物以及细菌、古细菌内都有发现丝氨酸蛋白酶抑制剂，提取到了1500多种，它们的分子量大小一般为40~100 kD[8]。
丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类高度保守的单链蛋白质，一般包含350~400个氨基酸残基,少数可达50 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
0个氨基酸残基[9]。X光衍射图谱分析发现，该类抑制剂的晶体结构一般为球状，包含9个α螺旋和3个β折叠。在距C约20个氨基酸残基处有一个暴露在球状蛋白表面的环状结构域RSL(Reactive site loop)，在RSL结构域中具有被丝氨酸蛋白酶识别的位点，一旦丝氨酸蛋白酶与该类抑制剂的RSL区域结合，就会将RSL裂解，形成一个酰基中间物，而断开的RSL将插入蛋白酶的活性中心，破坏活性中心的结构，进而抑制蛋白酶的活性(图1)。
图1[4] 丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI1 的三种构象（RSL标为深色，β sheet标为浅色）
RSL结构域可以作为该类抑制剂家族的标志，根据RSL结构的不同，将该类抑制剂分为三类：天然抑制、未激活、潜在抑制以及无抑制活性[4]。
丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调控丝氨酸蛋白酶的活性来维持机体内环境的稳态[10]。在人与动物体内，血液中存在重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，参与血液凝固和血压调节[11]。有研究表明，在神经系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有神经保护作用，能够有效调节中枢神经系统丝氨酸蛋白酶的动态平衡，如丝氨酸蛋白酶组织型纤溶酶原激活剂（tPA）及其同源性抑制剂PAII，对抑制神经变性、神经元死亡、以及脑损伤起着极为重要的作用[12]。在有关肿瘤方面的研究，丝氨酸蛋白酶参与肿瘤发生、发展和肿瘤细胞转移[13] 丝氨酸蛋白酶抑制剂可以影响癌细胞整合素的表达，而整合素表达的变化或函数直接参与血管生成，并且与肿瘤的生长和转移密切相关，使得这些受体有潜力成为新的药物靶点[14, 15]。加贝脂（Gabexate mesilate, GM）是一种人工合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂，已有报道说明其具有抑制人类结肠癌细胞生长、侵袭和转移的作用[16]。在炎症反应中，胰酶、心血管蛋白酶、凝固和纤维蛋白溶解因子以及补体系统的中间产物都属于丝氨酸蛋白酶，它们在炎症反应中起着核心的作用[17]。
丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有广泛的生物学活性和作用，尤其是在人体中发挥着重要的作用，其功能障碍将导致血栓形成、肺气肿、肝硬化、免疫系统的过敏以及神经性疾病等[18]。因此，丝氨酸蛋白酶抑制剂在新药研制和防治疾病方面具有广阔的前景。已知从细菌或植物中提取得到的某些无毒性丝氨酸蛋白酶抑制剂现在已可以商业应用于治疗丝氨酸蛋白酶诱导的皮肤炎症以及胃癌、HIV 等人体重大疾病。加强对丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究，深入研究其功能和结构之间的关系，阐明其作用机理，为临床实践奠定基础，同时，可以通过研究人体内抑制剂及靶酶的相互作用机制，探索相关疾病的致病机理，从而获得疾病防治的新思路[4,8,19,20]。
2材料与方法
2.1实验动物和细胞
约安巨马陆(Prospirobolus joannsi)，由本实验室保存，夏季采于南京市紫金山地区，体长约8~11cm，至于室温下玻璃缸内培养；HeLa 细胞为人宫颈癌细胞，由本实验室传代保存，培养基为DMEM，含10%FBS，1%双抗，在37oC5%CO2环境下培养。
2.2菌株和载体
克隆载体pTG19T质粒与表达载体pET32a质粒保存于本实验室；BL21克隆感受态为本人制备；DH5∂感受态细胞购置于南京金斯瑞生物科技有限公司。
2.3主要试剂
Trizol®Reagent
Themo Fisher Scientific，美国
PrimeScript RT regent Kit
TaKara，日本
2ⅹsuperTaq Mix
TaKara，日本
Gel/PCR Extraction kit
Biomiga，美国
FastDigest EcoRI

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