桑椹花色苷的分离纯化研究
目 录
1 前言 1
1.1 桑椹花色苷的来源 1
1.2 花色苷的功能活性 1
1.3 花色苷的化学性质 2
1.4 桑椹花色苷的提取和纯化 3
1.5 本研究的主要内容和意义 5
2 实验材料与方法 6
2.1 实验材料与化学试剂 6
2.2 桑椹花色苷最大吸收波长的测定 7
2.3 桑椹花色苷含量测定 7
2.4 单因素设计 7
2.5 响应面设计 8
2.6 花色苷纯化 8
3 结果与讨论 10
3.1 花色苷最大波长的选择 10
3.2 乙醇浓度 11
3.3 液料比 11
3.4 提取温度 12
3.5 提取时间 13
3.6 响应面优化实验结果 13
3.7 纯化实验结果 19
结 论 20
致 谢 21
参考文献 22
附 录 24
1 前言
1.1 桑椹花色苷的来源
桑椹是桑科桑属植物桑树的成熟果实，桑属植物的适应能力较强，能在复杂环境下生存繁衍。据Kalpana D等[1]的报道，从北半球亚热带到南半球热带地区的气候都能满足桑树的生长条件，在东亚、北美、欧洲和非洲均有桑科桑属植物的分布。桑属植物不仅能异花授粉，还可以无性繁殖，在自然和人工的选择培育下形成了许多品种[2]。中国 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072#
的桑属植物分为15种、4个亚种，种类比较丰富的地区有云南、贵州、四川、西藏等西南部。桑椹为聚花果，成熟果实一般是长23 cm，直径12 cm的长圆形，由许多长约2 mm，宽约1 mm 的圆形小核果聚集而成。果实颜色包括暗紫色，黄棕色和棕红色等。据中国药典[3]记载，桑椹具有滋阴补血的功效。桑椹果成熟期为47月份，属于季节性强的热性浆果，果实无外皮保护，易腐化变质，在常温下不易保存。
1.2 花色苷的功能活性
越来越多的科学报告表明，富含花色苷的浆果或其提取物对人类和动物的健康具有广泛潜在的保护作用[4]，这与它可能存在的抗氧化作用有关。花色苷能吸收人体内的羟自由基、超氧阴离子和过氧化氢等，可防止大分子物质的氧化损伤，具有很强的清除自由基的能力[5]，此外还具有一定的还原能力，是天然抗氧化剂 [68]，能够减轻机体损伤，延缓衰老。流行病学研究表明，花色苷的摄入可以降低患心血管疾病、氧化应激和糖尿病的风险[9]。根据Wang等[10]的研究，抗坏血酸和维生素E的活性相似，而一些多酚类物质的活性比标准品高几倍。例如，矢车菊素的抗氧化活性是抗坏血酸的4.4倍。
花色苷属于水溶性色素，所含花色苷的种类和含量的不同都会影响植物、花和果实的颜色[11]。常见的花色苷类有矢车菊色素、飞燕草色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素和矮牵牛色素。其中半乳糖，葡萄糖，阿拉伯糖，木糖和鼠李糖是以单糖，二糖或三糖形式与花色苷类结合的最常见的糖苷[12]。桑椹中含有大量的水分，粗纤维、蛋白质、维生素、游离酸、花色苷等物质，其中花色苷为主要成分，因此花色苷含量是评价桑树利用价值的重要指标。邹堂斌等[13]研究表明不同品种的桑椹所包含的花色苷成分及含量也不尽相同。但主要成分还是矢车菊素和天竺葵素的衍生物。桑椹花色苷主要有4种，分别为矢车菊3O葡萄糖苷、矢车菊3O芸香糖苷、天竺葵3O葡萄糖苷和天竺葵3O芸香糖苷[14]。其中桑椹中含量较高的为矢车菊3O葡萄糖苷、矢车菊3O芸香糖苷[15]。下图为它们的结构式[16]。
矢车菊素3O葡萄糖苷 矢车菊素3O芸香糖苷
图1 桑椹花色苷结构
Fig. 1 The structure of anthocyanins
1.3 花色苷的化学性质
花色苷是类黄酮物质，花色苷元上含有多个羟基属极性分子。根据相似相溶的原理，花色苷易溶于水、乙醇、甲醇和丙酮等具有较强极性的溶剂，不溶于乙醚和氯仿等极性较弱的有机溶剂。花色苷在不同pH水溶液中颜色会发生变化，酸性条件下呈红色，随着pH值的升高，花色苷水溶液逐渐变为无色，在碱性条件下变成蓝黑色。张玉清等[17]的研究表明，花色苷在不同pH下颜色变化的主要原因是其结构发生了改变。当pH小于3时，花色苷在水溶液中存在的形式为2苯基苯并吡喃阳离子。pH小于7时，以醇型假碱或查尔酮的形式存在。pH大于7时，花色苷的主要存在形式为醌型碱。花色苷在可见光区的最大吸收波长一般在520 nm处。花色苷在酸性条件下稳定，在碱性条件下其结构易发生变化。高温和有氧会使花色苷分解，长时间的光照也会使花色苷发生变性褪色。因此，花色苷的贮藏和运输因尽量保证在避光、低温和无氧条件下进行且花色苷在酸性条件下比较稳定。
1.4 桑椹花色苷的提取和纯化
1.4.1 桑椹花色苷的提取
1.4.1.1 传统溶剂提取法
水是一种强的极性溶剂是最常使用的溶剂。水能将无机盐、糖类、氨基酸、蛋白质等极性分子溶出。部分物质虽然能溶解于水，但溶解度不高。花色苷类的色素在提取过程中如果用纯水做为提取剂，提取率较低且在提取液浓缩过程中有一定困难。因此极少采用纯水作为提取剂。
亲水性的有机溶剂是与水能混溶的有机溶剂，如乙醇和甲醇都为最常用的有机溶剂。乙醇有较好的溶解性能，能穿透植物细胞的细胞壁，将细胞内的极性分子溶解析出。除蛋白质、果胶、淀粉和部分多糖外，乙醇还可以溶解许多亲水性物质，不同浓度的乙醇可以适用于不同性质的待提取物。因此，乙醇在提取工艺中应用最为广泛。亲脂性的有机溶剂是与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、氯仿、和乙酸乙酯等。这些溶剂的选择性能强而且易挥发，方便提取液的浓缩。但亲脂性有机溶剂不能提取亲水性物质。因此，在大量提取花色苷时，直接使用亲脂性溶剂是不合适的。
1.4.1.2 酶法提取
酶法提取广泛应用于在食品工业。花色苷主要是在皮下组织的外层（皮肤）中被发现的，而在果肉组织中很少或根本不存在。在细胞中，花色苷以小颗粒的形式存在于液泡中[18]。因此在提取花色苷时破坏细胞壁将花色苷释放到溶剂中可以提高花色苷的提取率。酶法提取所使用的的酶主要有纤维素酶和果胶酶。纤维素酶是可以将水解纤维素β1,4葡萄糖苷键水解使纤维素分解为葡萄糖和纤维二糖的酶的总称。纤维素酶的作用机理是使植物细胞的细胞壁发生软化和膨胀，破坏细胞壁（膜）从而达到提高细胞内含物提取率的目的。果胶酶与纤维素酶作用类似，是分解细胞壁和细胞膜中的果胶成分，改变了细胞壁（膜）的结构，增加细胞破壁，促进细胞内花色苷的溶出。
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