油菜是一种适应性很强的作物，如耐盐、干旱、高温等。现代生物分子生物学借助其这种适应特点，通过转基因等方法获得抗逆性更强的新品种。本实验以甘蓝型油菜‘南盐油1号’为实验材料，利用已知的油菜NF-YA9全长序列和PLANTCARE预测油菜NF-YA9启动子的顺式作用元件，分析后将启动子分成5段，通过Primer Premier 5设计各段的引物并完成克隆。最终将部分片段通过双酶切和酶连成功构建含536bp片段的Binary vector pCAMBIA-1300表达载体。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1相关背景1
1.1 NFY转录因子2
1.2启动子概述2
1.3顺式作用元件概述2
2材料与方法2
2.１材料2
2.1.1植物材料2
2.1.2菌种与载体2
2.1.3工具酶与试剂盒 2
2.2方法 3
2.2.1油菜DNA的提取3
2.2.2油菜BnNFYA9启动子的克隆3
2.2.2.1引物设计3
2.2.2.2启动子的克隆 5
2.2.2.3生物信息学分析6
2.2.3 含BnNFYA9启动子目的基因表达载体的构建6
2.2.3.1酶切位点的选择及含酶切位点引物的设计6
2.2.3.2 目的基因含酶切位点的高保真扩增8
2.2.3.3 构建表达载体8
3结果与分析9
3．1BnNFYA9启动子的克隆9
3.1.1普通PCR扩增结果9
3.1.2高保真PCR扩增结果10
3.1.3菌落PCR验证及测序比对结果10
3．2含BnNFYA9启动子目的基因表达载体的构建11
3.2.1含酶切位点的高保真PCR扩增结果11
3.2.2目的基因片段双酶切结果12
4讨论12
4.1 PCR法扩增启动子12
4.2后期研究和展望12< *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
br /> 致谢13
参考文献14
油菜NFYA9的启动子的克隆以及功能片段筛查研究
引言
引言 油菜，十字花科芸薹属，根系笔直，茎直立，分枝少，主要包括芥菜型 (B．Juncea)、甘蓝型 (B．napus)和白菜型油菜(B．rapa)3个栽培种。油菜作为我国主要的油料作物之一，其特点是在逆境环境下生长，给人类带来环境效益的同时又带来经济效益。我国的沿海滩涂资源丰富，滩涂面积高达 21709 km2，其中江苏省沿海滩涂面积达 0.5×104 km2，占全国滩涂面积的24%[1,2]。随着现代盐土农业概念的提出，沿海滩涂耐盐作物种质的研究和挖掘在最近几年也已相继取得一些进展。此次实验用的是甘蓝型油菜‘南盐油1号’ ，它是由大学自主研究，并在滩涂上种植而选育出的具有很好耐干旱、耐盐等逆境胁迫的油菜品种。通过克隆油菜BnNFYA9启动子，为后续研究启动子上的顺式作用元件提供条件，也为将来油菜的抗逆品种的培育提供一些帮助。
1 相关背景
干旱、低温和盐分等非生物胁迫因素危害了植物的生长和影响农作物的产量。如在盐胁迫条件下，植物叶片中的钠、钾离子的比率会升高，从而降低了植物的光合作用，影响了植物的代谢[3]，植物必须通过形态和生理等方面进行调节来维持生长和繁殖[4]。长期以来，人们一直在培育和改良能在不同逆境胁迫条件下生长的经济作物并对其相关抗逆基因和转录因子进行分析[5]。研究发现转录因子有提高植物抗逆性的特点，并以此来改良植物对非生物胁迫的综合抗逆性[6]。而启动子能调节转录因子的表达，因此对启动子的相关研究亦非常重要。
1.1 NFY转录因子
NFY是由NFYA，NFYB和NFYC三种亚基组成的异源三聚体转录因子，称CCAAT盒结合因子[7]。三种亚基都包含一个保守区域，该区域是DNA结合或蛋白与蛋白互作的功能域[8]。NFY普遍存在于真核生物中，研究发现在植物体中其具有多种功能，如参与种子萌发、花期调控、耐盐旱等[9]。根据已有研究，在油菜中已发现有14个NFYA，14个NFYB和5个NFYC[10]。油菜NFYA9是NFY复合体中的A亚基家族成员，研究发现它能与CCAATbox结合并激活下游基因的表达，参与植物生长发育的调控、逆境的胁迫响应以及生物固氮等生命活动过程。
1.2 启动子概述
启动子（Promoters）可以调控转录因子的表达，是生物基因中的一个重要组成部分，通常位于基因5’端上游长度约为1000bp左右的一段序列。启动子就像“开关”，控制基因的时间和空间表达，决定基因转录等活动并能够与转录因子特异性结合。它还能够与RNA聚合酶特异性结合并活化RNA聚合酶，决定基因的转录起始位点。基因工程上通常用的是35s启动子，包括CAAT盒子、TATA盒子、增强子核心序列和反向重复序列这四个部分，被广泛应用于植物的转基因过程。为了提高植物外源基因的表达水平，可以对启动子这些序列进行改造，也可以将启动子的一些元件进行串联。另外还对部分基因启动子区域的分析研究，还发现功能蛋白基因的启动子基本都含有相同的结构形式，通常称为保守序列，保守序列又与结构共同作用指导基因的精确转录。
1.3 顺式作用元件概述
顺式作用元件（Cisacting element）是指位于基因5’端上游，是能与转录因子（反式作用因子）相结合的特定碱基序列。其不仅可以调控基因转录的起始，还可以调控基因的转录效率。目前研究发现植物基因的启动子中含有一些重要的顺式作用元件，部分还是转录调控的核心。植物启动子包含多种不同类型的顺式作用元件，其中一些对逆境胁迫而响应相关的作用元件通过对外源基因的表达调控，使植物在胁迫环境下更具有生命力[11]。启动子中的不同顺式作用元件决定着启动子的功能，一些包含如Gbox、ABRE、MYB和MYC等调控元件的启动子，他们调控的基因可能参与植物的发育转变、组织分化及胁迫响应等生理生化过程，例如ARE响应ABA，ABRE依赖于ABA[12]。对顺式作用元件的研究可以通过对启动子的功能片段的研究来进行，这对研究基因功能也有很重要的帮助。

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