研究cep作为氮素信号对植物根系的调控作用【字数：6173】
nd shoots in plants. CEP as a plant peptide hormones, plays an important role in regulating the process of plant development via cell-to-cell communication in a non-cell autonomous manner. Beside Arabidopsis, the function and mechanism of CEP on the root development in other plant species are still unknown. In this study, we studied the role of CEP small peptide molecules on the regulation of root development and nitrogen uptake in rice and Arabidopsis. We found that CEPs had different functions between Arabidopsis and rice as OsCEP was still related to nitrogen regulation.氮 (Nitrogen, N) 作为植物生长所必需的大量营养元素，是植物生长发育的重要限制因子，因此植物的高产优质离不开氮肥的施用。然而，氮肥过量施用导致水体富营养化、土壤污染、土壤酸化等一系列生态环境问题 [1,2,3]。因此，揭示植物，尤其是作物对氮素供应状况的响应机制，培育氮素高效的农作物新品种，确保在有限的水肥等资源投入条件下的高产、稳产和优质，是现代农业可持续发展的必然需求。在自然生态条件下，植物氮素来源主要是通过根系从土壤中吸收无机形态的铵态氮(NH4+) 和硝态氮 (NO3-)。有趣的是，根系具有快速感应土壤中的氮素 (包括形态和浓度) 分布的能力，并且在不同氮供给条件下，植物能够启动复杂的基因调控网络，调控根系的发育模式来适应氮素的浓度和形态， 如根系空间结构的改变、主根伸长、侧根及其根毛的形成和生长等[4,5,6]。植物感受氮素信号的方式可分为两种类型一种是 “局部” 响应氮素信号转导途径，另一种是 “系统” 或 “长距离 (long-distance)” 氮素信号转导途径。“局部” 信号主要由外界环境中 (通常指根系周边的土壤溶液中) 的氮浓度及植物根系对其的感应和吸收决定，引发局部 (根部) 内源信号的时空分布对氮素信号通路的响应。在拟南芥中，已经明确分布在根端分生组织和伸长区的外层组织上，特别是在侧根根冠和表皮细胞上的硝酸盐转运蛋白Nitrate Transporters (NRTs) 和铵转运蛋白Ammonium Transporters (AMTs)参与其响应 [20]。这暗示植物可能通过根尖直接与外界氮素环境接触，感应土壤中氮素的时空分布，并改变根系生长的速率和延伸方向，因此其发生速度快。“系统” 信号是由植株整体的氮素水平或者说植物体内的氮素浓度及其动态平衡决定的，因此系统 (整株植物) 的缺氮信号通路主要发生于根系在感应和吸收环境中的氮素之后。系统氮素信号通路涉及氮素信号在根部与地上部之间的传递，所以相对较慢。系统氮素信号转导通路调控植物根系的发育形态，如根系结构调整、主根的伸长、侧根的发生和根毛的形成等。近二十年来，植物硝酸盐和铵盐的吸收转运机制研究较为深入，基本上明确了硝酸盐转运体NRT1s、NRT2s 和铵转运蛋白AMTs家族对植物氮素吸收起决定性作用，并直接或间接地影响根系的发育[7]。但是，植物怎样将吸收的氮素营养这一外部信号转化为内源信号，调控根系的生长和发育依旧不清楚。在拟南芥中最新的研究发现，C末端编码的小肽分子C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE (CEP) 基因家族调控根部NRT1基因的表达，并作为长距离信号分子调控植物侧根的生长和地上部的生长和发育[8]。因此，CEP小肽可能作为重要的内源信号分子感受外源氮信号，并将其转化为生长信号，调控植物根系发育模式。尽管其它长距离信号分子如生长素、小RNA、钙信号也被发现参与植物对氮素响应的信号转导途径，但它们同时也参与植物其它复杂的生理生化反应 [9,10,11,12,13]，并且这些信号分子之间的相互关系也知之甚少。相反，CEP小肽分子可能作为专一的信号分子调控植物根系对氮素的响应。在植物中，这些小分子信号肽主要包括两大类 [30]1）富含半胱氨酸的小肽分子，其特点是典型的成熟肽，长度小于160氨基酸；2） 另一类是翻译前修饰小肽，是由翻译表达的较长的前体蛋白经过修饰裂解形成的有活性的成熟多肽 (长度小于20个氨基酸)。值得注意的是，已有报道发现蒺藜苜蓿中的微小RNA分子miR17和拟南芥pri-miR165a均可编码小肽，具有促进植物侧根发育的功能 [16]。有趣的是，尽管小肽是非常短小的，但是基因组比对的结果显示无论是单子叶还是双子叶中，这些长度上大多少于20个氨基酸的小肽 (如CEP小肽) 在进化上均是非常保守的 [30]，但其在拟南芥以外其他作物根部生长发育中的功能及作用机制尚不清楚，有待进一步研究。CEP家族多肽由15个氨基酸组成，携带2到4个可能被羟基化的脯氨酸残基。在拟南芥中，目前发现CEP家族有15个基因，CEP1、CEP2、CEP3、CEP4、 CEP5的表达主要发生在根中。缺失功能的CEP3突变体能促进根系发育，而某些CEP家族基因的过表达会抑制根系生长，例如过表达CEP1或人工合成的CEP1小肽会抑制侧根的形成，促进根瘤的发生。另外，CEP小肽的受体LRR-RK激酶CEP RECEPTOR1（CEPR1）和CEP RCEPTOR2(CEPR2) 也在拟南芥中被鉴定 [8]。硝酸盐转运体1.1（NRT1.1），硝酸盐转运体2.1（NRT2.1）和硝酸盐转运体3.1（NRT3.1）这些基因是植物需氮信号的受体，并编码了参与根系硝酸盐运输系统的主要蛋白。CEP1能够诱导NRT1.1，NRT2.1和NRT3.1表达，但CEP1对氨和其他大量营养元素的转运体只有极小的影响。另外，在拟南芥幼苗中，有10个CEP基因的过表达会诱导NRT2.1在根部的表达。这些结果暗示，CEP信号是植物产生N饥饿反应的基础[8]。而对于外源氮素，将在含有正常氮溶度的营养液中培养的拟南芥幼苗，移植到缺氮培养基中后，CEP1、CEP3、CEP5、CEP6、CEP7、CEP8和CEP9的转录水平在6小时后显著增加，并在24小时后进一步显著增加。同时，在低浓度的硝酸盐，铵盐和谷氨酸盐处理的幼苗中也可观察到这些基因表达量的显著增加。由此可得出结论， CEP1等七个基因的表达受到外源低氮信号的调控。此外，在拟南芥中，小肽信号广泛参与各种植物生长发育信号途径，如胚胎发育、根系发生等，其相应的分子机制也在解析中 [14,27]。但是，由于编码这些小肽的基因长度非常短，经常被低分辨率的基因测序和质谱分析忽略，在水稻等单子叶植物中还鲜为人知。可知，在水稻基因中共鉴定出15个CEP多肽激素基因，定位于水稻的6条染色体上[43]。本实验将以单子叶植物水稻和拟南芥为研究材料，深入研究氮素响应的CEP小肽分子在根系发育、氮素吸收利用调控中的作用机制，对挖掘氮素高效新基因，解析复杂的植物氮信号响应及转导调控网络具有极大的推动作用，并且其结果来自农作物，对氮素高效的分子育种具有更加直接的指导作用。1 材料与方法1.1 研究材料水稻野生型日本晴Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare/Shiokari； Kasalath (Kas)籼稻；中花粳稻；拟南芥野生型Col-0；OsCEP1、OsCEP6、AtCEP1和AtCEP5合成小肽由公司合成提供。1.2 实验试剂和仪器1.2.1 实验试剂NH4NO3、K2SO4、KH2PO3、Na2SiO3、EDTA-Fe、MgSO4、CaCl2·2H2O、无水乙醇、NaClO（次氯酸钠）等。1.2.2 实验仪器 PCR仪、天平、显微镜、扫描仪。1.2.3 培养基与营养液MS培养基NH4NO3 1650 mg/L、KNO3 1900 mg/L、CaCl2·2H2O 440 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、KI 0.83 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、烟酸0.5 mg/L、盐酸吡哆醇（维生素B6） 0.5 mg/L、盐酸硫胺素（维生素B1） 0.1 mg/L、甘氨酸2.0 mg/L。培养基不同的氮源培养基中的氮源的供给如下，正常供给条件2 mM NH4NO3和 2 mM KNO3，其他大量元素和微量元素以及各种必需维生素供给量不变，PH = 5.8。不同CEP培养基供给如下，1/2MS培养基加不同浓度和类型的CEP，PH=5.8。营养液NH4NO3、K2SO4、KH2PO3、Na2SiO3、EDTA-Fe、MgSO4、CaCl2·2H2O，PH=5.3。水培时，正常供给条件2.5mM NH4NO3和 2.5 mM KNO3；硝酸根供给2.5mM KNO3，其他大量元素和微量元素以及各种必需维生素供给量不变，PH = 5.3。1.3 方法和手段1.3.1 种子萌发拟南芥种子70%的酒精浸种1min，再用30%的NaClO浸泡15min进行灭菌，无菌水洗净；移至4 ℃冰箱中春化3 d；露白后点种至平板培养基中，放入22 ℃的培养箱培养5-6d；挑选根长势一致的幼苗转移至含有不同浓度和种类的CEP供给的MS平板中培养8天。水稻种子70%的酒精浸种1min，无菌水洗净，再用30%的NaClO浸泡30min进行灭菌，无菌水洗净；移入分化罐，放至28 ℃培养箱中，暗培养催芽3 d；挑选根长势一致的转移至含有不同浓度和种类的CEP供给的MS平板中培养8天。1.3.2 育苗培苗将植株在正常营养条件下萌发生根后转移到含有不同氮源和CEP供给的MS平板,每组两个重复，培养8天后使用扫描仪记录表型并测定侧根的数目和主根的长度。主根的长度通过ImageJ软件测量。侧根数目通过显微镜计数。后取根部样品，提取RNA，进行qPCR反应。1.3.3 提RNA1. 取100mg样品，液氮研磨（研钵或磨样仪），入2ml离心管，加1mlTRIzol试剂，涡旋或用力摇1min，室温置10min；4℃下，12000g，离心10min；看到分层。2. 取上清液至新1.5ml离心管，加200µl氯仿，盖好盖，用力摇15s，室温放置5min至分层；3. 4℃下，12000g，离心15min；转移上清液至新的1.5ml离心管；4. 加500µl氯仿，混匀，室温放置5min至分层；4℃下，12000g离心15min；5. 将上清液(400-500µl)转至新1.5ml离心管，加500µl异丙醇沉淀RNA，轻轻颠倒混匀，冰箱放置10min；6. 4℃下，12000g离心10min7. 弃上清，用75%乙醇1ml上下颠倒管子洗涤沉淀（每管配1.2ml；900µl无水乙醇+300µlDEPC水）；8. 4℃下，7500g离心5min；9. 弃乙醇（倾倒在吸水纸上），空气干燥RNA沉淀5-10min；10. 用20-50µl RNase-free dH2O或1%DEPC处理的水溶解RNA，枪头混匀，55℃溶解10min，或室温溶解20min。1.3.4 qRT-PCR基因表达分析对以上生理参数测定实验中的不同水稻材料的根部同时进行采样，液氮速冻后于-70℃储存。用TRIzol试剂提取其总RNA后，用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 对1 µg RNA进行去除基因组DNA处理和反转录反应，继而用SYBR Premix Ex Taq II在StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 (Applied Biosystem) 上进行qPCR反应。以水稻管家基因OsActin作为内参，用2-∆∆Ct方法计算各基因相对表达丰度。1.4 数据处理侧根数目通过显微镜计数。用扫描仪记录植物表型获得图片，图片处理采用ImageJ软件测量水稻和拟南芥主根长度。实验数据在Excel 2013程序中处理，再使用SigmaPlot 12.5软件制成柱形图。水培处理，使用照相机获得图片，图片处理采用ImageJ软件测量水稻主根长度。实验数据在Excel 2013程序中处理，再使用SigmaPlot 12.5软件制成柱形图。2 结果与分析2.1 人工合成AtCEP外源处理对拟南芥根系的影响/图一 不同浓度AtCEP对拟南芥根系的影响//图二 不同浓度AtCEP对拟南芥侧根数和主根长度的影响将拟南芥在正常营养条件下萌发生根后转移到含有不同浓度AtCEP1和AtCEP5供给的MS平板中培养8天后使用扫描仪记录表型，并通过显微镜测定侧根的数目和ImageJ软件测定主根的长度。从图一可以看出，与对照相比，经过AtCEP外源处理的拟南芥，其根系主根长度明显变短，侧根数也明显减少。加入的浓度越大，变化越明显。在图二中，1 µM AtCEP1处理的拟南芥根上侧根数量显著减少，减少了38%左右。同理，经过10 µM AtCEP1处理的拟南芥侧根数量继续减少，主根上平均产生不超过4个侧根。从图二可看出，经过不同浓度AtCEP5处理的拟南芥，其侧根数量变化与AtCEP1处理的拟南芥类似。同时，经过AtCEP处理的拟南芥主根长度都显著变短，浓度越高，主根越短 （图二）。并且AtCEP5处理的拟南芥比AtCEP1处理的，主根长度变化更明显，主根更短。与对照相比，1 µM 浓度下，AtCEP1缩短了近29%，AtCEP5缩短了近34%。最近，Tabata等[8]在科学杂志上报道在根部分泌的AtCEP1小肽有可能通过其受体LRR-RK激酶调控根系中NRT1的表达，继而影响根系对氮素的吸收。由于AtCEP1和其家族基因AtCEP5在根部的维管组织中表达，而LRR受体却定位在地上部并且特异性调控地上部的发育，故表明CEP1是作为长距离信号分子响应外源氮素[8,30]。AtCEP1抑制了拟南芥根系的生长，根尖分生区变小，根尖成熟区细胞变小。2.2 人工合成AtCEP外源处理对水稻根系的影响图三 AtCEP5对水稻根系的影响。图片中AtCEP5 小肽的使用浓度为 10 µM。经过AtCEP5处理的拟南芥根系的主根长度显著变短，而经过AtCEP处理的水稻根系的主根长度却变长。从图三来看，经过10µM AtCEP5处理的水稻主根比经过30µM AtCEP5处理的增长量更大。从图二和图三可以得出，AtCEP5处理水稻与处理拟南芥的结果不同，有可能是因为AtCEP是拟南芥的CEP，因此对水稻并没有抑制效果。2.3 人工合成OsCEP外源处理对水稻根系的影响 /图四 OsCEP6对水稻根系的影响。图片中OsCEP6 小肽的使用浓度为 5 µM。分化罐生长3d后，挑选根长势一致的移入到加有外源合成OsCEP的平板上，生长8d后观察根系表型，从图四可看出，OsCEP6处理对水稻根系主根长度的影响不大。2.4 人工合成OsCEP外源处理对拟南芥根系的影响/图五 OsCEP对拟南芥根系的影响。图片中OsCEP1 小肽和OsCEP6 小肽的使用浓度为 5 µM。//图六 OsCEP对拟南芥根系的影响。图片中OsCEP1 小肽和OsCEP6 小肽的使用浓度为 5 µM。在正常营养平板上生长5-6d后，挑选根长势一致的移入到加有外源合成OsCEP的平板上，生长8d后观察根系表型，经过OsCEP处理的拟南芥侧根数量明显变少，从图五来看，OsCEP6处理的拟南芥侧根与对照相比，少了50%，显著减少；OsCEP1处理的侧根数量显著减少近了40%，。从主根长度来看，经过OsCEP1处理的拟南芥主根明显变短，显著变短16%。同样，经过OsCEP6处理的主根变化更明显，短的更多，是对照主根长度的65%。2.5 人工合成AtCEP对kas根系的影响—水培/图七 水培条件下AtCEP对kas根系的影响。图片中各处理使用浓度为 5 µM。/图八 水培条件下AtCEP对kas主根长度的影响。图片中各处理使用浓度为 5 µM。水稻Kas品种，经过灭菌消毒后，温室水培培养5d后，拍照，用ImageJ软件处理。从图七可看出，铵根培养的地上部颜色呈绿色；硝酸根处理的地上部颜色发黄。如图八所示，加入AtCEP5小肽的硝酸铵处理的水稻主根比硝酸铵单独处理的水稻根长度要长；相比较而言，加入AtCEP5小肽的硝酸盐处理的水稻主根也比单独硝酸盐处理的水稻主根根系长，增长了约15%。2.6 人工合成AtCEP对中花根系的影响—水培/图九 水培条件下AtCEP对中花根系的影响。图片中各处理使用浓度为 5 µM。/图十 水培条件下AtCEP对中花主根长度的影响。图片中各处理使用浓度为 5 µM。水稻中花品种，种子经过灭菌消毒后，温室水培培养5d后，拍照获得水稻表型，用ImageJ软件测量水稻的主根长度。从图九同样可看出，铵根培养的地上部颜色呈绿色；硝酸根处理的地上部颜色发黄。从图十可知，加入AtCEP5小肽的硝酸铵处理的水稻主根比硝酸铵单独处理的水稻根长度要长；相比较而言，加入AtCEP5小肽的硝酸盐处理的水稻主根也比单独硝酸盐处理的水稻主根根系长，增长了约10%。2.7 缺氮情况下水稻中CEP基因的表达/图十一 缺氮情况下水稻中CEP基因的表达将在正常条件下培养3d的水稻幼苗，一部分缺氮处理，一部分继续正常培养，6h后取根尖2cm处，提取RNA进行Q-PCR分析。从图中可以看出，在缺氮情况下，OsCEP2、OsCEP3、OsCEP7、OsCEP10、OsCEP11、OsCEP14 表达量显著上调。因此CEP可能受氮素特异性表达调控。3 讨论本次实验发现，人工合成的AtCEP外源处理使拟南芥根系的主根显著变短，侧根数目显著减少，然而，人工合成的AtCEP外源处理使水稻根系的主根增长。并且，人工合成OsCEP外源处理对水稻根系并无显著影响，这有可能是AtCEP在拟南芥和水稻中行驶着不同的功能。Sui Z等人发现人工合成的OsCEP6.1使水稻根系的主根长度变短，并解释是由于细胞变小造成的，而细胞数目并没有发生显著改变[43]， 这与我们的观测结果不一样。这可能与使用的人工合成小肽的纯度以及用于小肽处理的水稻苗期的不同有关，具体的解释需要在获得突变体材料后进一步开展研究。同时，在拟南芥中，CEP小肽已经被证实与氮素吸收有关，CEP可以提高NRT的表达从而促进根系对氮素的吸收[8]。植物根系缺氮时会发出需氮信号，此信号最终会诱导NRT的表达，使植物更好地适应缺氮环境。这种长距离运输的系统应答机制在硝酸根为N源的情况下尤为显著。Ryo Tabata等证实，CEP多肽参与了植物需氮信号的传导[8]。在拟南芥中，根系将饥饿信号传递到地上部，小肽CEP的受体CEPR将饥饿信号传递到地上部，促进NRT2.1的表达量上调，促进氮素吸收。于是，推测水稻中OsCEP的表达是否因为不同氮素行使不同的功能。我们的研究结果也显示，在缺氮情况下，水稻中CEP基因的表达与正常供氮条件相比明显上调，例如OsCEP2、OsCEP3、OsCEP7、OsCEP10、OsCEP11和OsCEP14 表达量显著上调。因此水稻CEP小肽编码基因在根部的表达与可能受到氮素调控。后面将用NH4NO3和KNO3处理水稻，外源施加OsCEP，进一步探索NO3-下对水稻根系的影响。我们将继续用敲出和过表达材料，进一步研究CEP在水稻中行使的功能作用，探讨CEP小肽分子在根系发育、氮素吸收利用调控中的作用机制。致谢本论文主要是在导师宣伟教授的指导下完成，感谢他对我的悉心教导，也感谢陈玉琴师姐和宋彩虹师姐对我的督促和指导。在我做实验的过程，实验室的师兄师姐们都给予了很大的帮助和指导。在他们的帮助下，我学会了很多实验技能并完成我的毕业实习和毕业论文的撰写，在此致予他们最真诚的敬意与感谢！参考文献[1] Chen, X., Cui, Z., Fan, M., Vitousek, P., Zhao, M., Ma, W., Wang, Z., Zhang, W., Yan, X., Yang, J., et al. 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目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 研究材料 3
1.2 实验试剂和仪器 3
1.2.1 实验试剂 3
1.2.2 实验仪器 3
1.2.3 培养基与营养液 3
1.3 方法和手段 4
1.3.1 种子萌发 4
1.3.2 育苗陪苗 4
1.3.3 提RNA 4
1.3.4 qRTPCR基因表达分析 4
1.4 数据处理 4
2 结果与分析 5
2.1 人工合成AtCEP外源处理对拟南芥根系的影响 5
2.2 人工合成AtCEP外源处理对水稻根系的影响 6
2.3 人工合成OsCEP外源处理对水稻根系的影响 7
2.4 人工合成OsCEP外源处理对拟南芥根系的影响 7
2.5 人工合成AtCEP对Kas根系的影响—水培 8
2.6 人工合成AtCEP对中花根系的影响—水培 9
2.7 缺氮情况下水稻中CEP基因的表达 10
3 讨论 11
致谢 11
参考文献 11
研究CEP作为氮素信号对植物根系的调控作用
引言
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/hxycl/zyyhj/561000.html
