一氧化氮参与钾胁迫对烟草根系生长的影响【字数：6422】
ects of NO-donor (SNP), NO-scavenger (cPTIO), NR-inhibitor (tungstate), and NO-synthase-inhibitor (L-NAME) on elongation of first-order lateral-root (LR). Compared with control-treatment, LK-tolerant cultivar NC89 maintained plant growth under LK at 14 days, while dry weight was reduced significantly in LK-susceptible cultivar Yunyan1. Low-K+-inhibited root growth, mostly by impairing first-order LR’sformation and elongation, was only recorded in cv. Yunyan1. NO accumulation increased in root tips even when cv. Yunyan1 subjected to LK at day 1. LK-induced NO was generated by NR-pathway during early LK. SNP-application to control-treated plants decreased first-order LR elongation to levels similar to LK-treatment in cv. Yunyan1, while cPTIO, L-NAME, and application had the opposite effect. Further results suggested that NO might be involved in auxin-mediated LR elongating as plants responding to LK. In conclusion, NO generated by NR pathway may be involved in the inhibition by LK-stress of first-order LR elongation in tobacco plants.简介钾离子是植物生长发育中一种必需营养物质。可以占到植物干重的10%以上，而且是植物细胞中最重要的阳离子。然而，土壤中的钾离子浓度在0.025–5.0 mM，但是在根际中，浓度一般小于0.3 m[1]。即使在肥沃的土壤中，钾离子的可利用性也和环境条件有关，比如说土壤湿度和土壤密度[2]。所以说。植物可能经常性经历钾离子缺乏的情况。植物通过改变根系结构来应对养分缺乏的能力是适应环境的基本要素。很多种植物根系的生理、代谢、形态都会因为低钾胁迫而发生改变。例如拟南芥、棉花、大麦、水稻等。Drew的一项研究显示，当K+仅提供该根系的特定部分时候，会促进大麦幼苗侧根的生长。与此相反，模式植物拟南芥的幼苗在相同情况下侧根的的生长和延伸则受到影响显著降低[3]。有趣的是Kellermeier等人的研究显示，低钾条件下拟南芥的主根和侧根生长似乎存在拮抗作用，说明了根的形态决定于所获得的物质多少。虽然在生理水平上，植物根系对K+缺乏的反应十分明确，这些变化的内在机制仍不清楚。根系生长受外在环境信号和内在发育程序的调节，越来越多的资料表明，K+缺乏条件下的根系形态是由植物激素如乙烯和生长素的调节.。通过在中柱增加PIN3和PIN7转录增强生长素运输向根，导致在分生区的生长素积累。信号分子一氧化氮（NO）在根生长调节中也起着举足轻重的作用，而且较高水平的NO没有减少植物分生组织的活性。Sanz等人报道称，NO减少的主根的伸长，而NO缺陷突变株的根分生组织小，表明NO在调节干细胞分化总起重要作用。而Lira-Ruan[4]等人研究称，NO在拟南芥主根分支上具有双重效应，在处理前形成的根部分稍微促进分支，并在处理期间形成的根部强烈抑制分支。研究表明，NO参与根系发育，营养缺乏调节.因此，可以推测，在缺钾条件下，NO也参与根生长的信号转导通道。然而，NO在信号转导通路中的作用，需要进一步调查。烟草是世界重要的经济作物之一。缺钾已经严重限制我国烟草生产业，所以增施钾肥是获得预计产量的必要手段。现代农业支持的是可持续发展的 ，发现能够高度忍耐低K+情况基因型可能是一个有价值的目标。在这项研究中，两个烟草品种表现出不同的生长特征，在加低K+胁迫下进行检查，以阐明潜在烟草对K+缺乏的耐受机制。在试验期间，我们发现了LK耐受型（NC89）和LK敏感型（云烟1号）。除此之外，NC89能够在试验期间保持生长，包括根系形态，而在云烟1号上则表现为LK抑制其生长。而且，我们的研究结果表明，NO通过调节烟草一级次根的伸长，作为一种适应LK的重要作用。材料和测定方法2.2.1植物生长两种基因型的烟草，低钾耐受型NC89和低钾敏感型云烟1号被选中作为实验材料，两个烟草基因型是从预实验中35个在K+缺乏的条件的不同反应中选取的三个相互独立的生物实验。种子发芽的托盘填充泥炭和蛭石的混合物（比例为1:1）在日光温室和白天/夜间温度28 / 22°C。二十五天的苗按照大小和活力均匀移载到带孔盖子的7升桶（每盖十孔每孔一苗）。用四分之一浓度霍格兰营养液(Hoagland and Arnon 1950)进行供应14天和21天。幼苗，然后进行两种处理K+缺乏(LK, 0.01 mM)和正常营养 (对照组, 2 mM)， K+源为K2SO4。营养液由1.25 mM Ca(NO3)2, 0.25 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgSO4·7H2O, 20.0 µM Fe-EDTA, 9.1 µM MnCl2, 0.5 µM (NH4)6Mo7O24, 46 µM H3BO3, 0.8 µM ZnSO4,和0.3 µM CuSO4.组成。每天更换的营养液和曝气30分钟，以保持最佳的氧含量。每个处理重复4次，并遵循完全随机的设计，以避免边缘效应的发生。此外，所有实验包括三个独立的生物复制。植物经过14天或21天的处理后收获。根系样品快速冷冻在液氮，并且储存在–70(C，直到进一步的测量。本次研究进行了预实验，用于确定NC89和云烟1号适当的用量。硝普钠(SNP)的药理反应性在两种烟草中不尽相同。比如施用1或者2.5 µM SNP就可以抑制云烟1号的一级侧根的生长。当云烟1号在相似LK处理下，而和对照组相比，NC89施用SNP (≥ 7.5 µM)才能抑制了一级侧根的生长。随后7.5 µM的SNP用于NC89, 2.5 µM的SNP用于云烟1号。同理，80 µM的cPTIO，50 µM的钨酸钠，100 µM 的L-NAME，20 nM的NAA和60 nM的NPA每天用于实验中。2.2.2根系结构记录尽管烟草是一种双子叶植物，但是其主根得分化却不像那些典型的双子叶植物[5]。在水培处理的过程中，第一级和第二级的侧根发展差异显着，但在主根上差异不显著。所以我们没有观察主根，而是观察一级和二级侧根的数据。我们测量根长和根的体积用的是WinRhizo根系扫描仪。一级侧根的长度用尺子直接衡量，二级侧根的长度用分析仪器测得。一级侧根数量可以直接目测，计算二级侧根的密度是通过划分二级侧根的数量和一级侧根的长度得来。2.2.3钾浓度测定干燥的样品被研磨成粉。约50毫克的粉末消化在H2SO4和H2O2在270°C加热，冷却后，样品被稀释到100毫升用蒸馏水。电感耦合等离子体发射光谱法测定K+浓度2.2.4根尖NO含量的测定一氧化氮准备用一氧化氮探针(DAF-FM DA)和荧光显微技术进行检测，根尖用µM DAF-FM DA和20 mM HEPES-NaOH缓冲液在pH为7.5的环境下，暗处反应30分钟后，根尖用新鲜缓冲液清洗三次后，立即采用体视显微镜和彩色CCD摄像机进行成像，激发光源波长为448nm，记录在495–575 nm之间的光谱(Olympus MVX10)。根据得到的图像中的绿色荧光的信号强度，利用PS软件进行量化处理。数据通过根尖区域，由PS图象处理软件分析像素强度相对单位得到。在根尖的绿色荧光的背景数据是没有经过10 µM DAF-FM DA处理的。最终10 µM DAF-FM DA处理后的绿色荧光数据减去背景数据，可以用来计量NO的荧光数据。2.2.5硝酸还原酶（NR）活性测定本实验使用的方法在Ogawa[6]等人描述测量烟草根系硝酸还原酶活性（1999）的基础智之上修改得来。测定硝酸还原酶（NR）的测定体系由25 mM pH为7.5的磷酸钾缓冲液，10 mM KNO3, 0.2 mM NADH, 5 mM NaHCO3和5 µl的待测样品，定容到0.5ml。加热到30°C，保持15分钟。然后向体系加入50 µl的0.5M Zn(CH3COO)2。过量的NADH用50 µl的0.15 mM吩嗪硫酸二甲酯氧化。然后混合体系在10,000G下离心五分钟。取500µL上清液加入250µL 1% 对甲基硫甲苯，1.5 N HCl和250µL 0.02% N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐，在540 nm的分光光度计测得产生的NO2–的量。2.2.6qRT-PCR分析通过烟草中NR基因(NtNIA1, LOC104097998; NtNIA2, LOC104248549)，K+转运的通道基因(NtHAK1, DQ841950.1; NtHKT1, LOC104095513; NtNKT1, AB196790.1)，根分生组织内细胞周期活性的标记基因(NtCYCB1;1, Z37978.2)的表达水平和稳定的参考基因NtL25 (L18908.1)的表达水平相对比，然后提取提取RNA，反转录,qRT-PCR，引物数据列于表1中。表1NtNIA1-2, NtHAK1, NtHKT1, NtAKT1, NtCYCB1;1NtL25用于qRT-PCR的引物Gene Primer sequenceNtNIA15-GTTCAGTCACATAGAAGCCG -35- CAATCCAGTTATCAGCGGTA -3NtNIA25-AGAGTTAGAGCCATCTGTTCACG -35-TACGAACATAATGAAGTGGGACC -3NtHAK15-TCAACTGGCTGCTCACC-35-GGTGGAAAGCAGGTAGG-3NtHKT15-GCTCCTTGCTTACGCCT-35-CCAGCAGTGGCTTCAGA-3NtNKT15-TCTCTTCCTAAAGCCATCC-35-CTGCCTTCATTTCCGAGAC-3NtCYCB1;15-AACCTTGTGCCTGCTCCTGC-35-AAAGTCCACAAGCAGCCT-3NtL255-AGTCTTAGGTCGGTGGA-35-AGCTGGTAGATTTCTCGT-32.2.7数据分析实验数据汇集计算的手段和标准误差（SE），并进行学生的t检验或单因素方差分析（ANOVA），其次是多重比较测试（LSD）。所有的统计程序进行使用SPSS版本。11软件（SPSS公司，芝加哥，IL，美国）。在所有分析中，P＜0.05显著差异。结果3.3.1两个品种烟草对钾缺乏的反应与正常处理（CK）相比，K+缺乏处理14天下，云烟1号的幼苗和根系生长显著降低（图1a-b）。钾缺乏显著降低云烟1号地上部和茎干重46%和42%。有趣的是，我们检测到两个处理中，NC89的烟草生长没有显着差异。为了进一步分析缺钾对烟株生长的影响，我们延长了烟株的生长时间。21天时，与对照组相比，NC89的茎、茎干重下降21%和23%，而云烟1号下降约50%（图1c）,可以看出云烟1号为K+缺乏的敏感型而NC89则为K+缺乏的耐受型。 /图1 两个品种烟草的生长情况/图2 两烟草品种的钾浓度和两种相关转运蛋白的相对表达量钾缺乏显著降低烟草14天根和芽中K+浓度（图2a），而且云烟1号K+的减少比NC89要迅速。此外，在两个高亲和力钾转运蛋白相对表达中也观察到了类似的趋势（HAK1和HKT1）而非一个内向K+通道（调节剂）（图2b）。这些可能解释为何NC89有比云烟1号更强的抵抗K+缺乏的能力。3.3.2缺钾抑制云烟一号的一级侧根的生长和延长与对照组相比，在14天中，钾缺乏显着降低云烟1号根系生长，而NC89的根系生长则未见明显影响。（图3）钾缺乏显着降低总根体积和长度云烟1号和相对于对照组总根体积和长度分别减少了44%和37%，分别。进一步的分析表明，与对照相比，缺钾降低一级侧根总体积和长度的36%和37%。然而，我们发现在二级侧根，处理之间的根系密度和平均长度无显著性差异，类似于我们以前的报告。/图3 两个烟草品种的根形态汇总/图4 两个烟草品种一级侧根中的NO积累3.3.3缺钾使云烟1号中NO含量增加，而NC89则不增加信号分子一氧化氮（NO）在根系生长调控中起着举足轻重的作用，要确定是否NO参与一级侧根在缺钾情况下是否延伸，我们在第1天和第14天测量两个烟草品种根尖上与NO相关的绿色荧光（图4）。在实验的第一天，与对照组相比，条件下，云烟1号的NO相关的绿色荧光呈现明显增加（图4a,c）。荧光信号强度显示，K+缺乏诱导云烟1号的根尖积累NO，从第一天的的74%上升到第十四天的114%。而而在两个处理下的NC89则没有显示出显著差异（图4a-b）。3.3.4低钾情况下通过硝酸还原酶途径诱导NO含量增加硝酸还原酶（NR）被认为是植物NO产生的重要酶途径，我们对两种烟草的根在第1，2，7，14天的NR活性进行了测定（图5a-b）。两个烟草品种NR活性随时间变化趋势不同。例如，云烟1号在经过K+缺乏诱导后，相关NR活性在第一天和第二天有83%和46%的增加，然后后逐渐降低。qRT-PCR分析表明，此过程中云烟1号的NIA1 and NIA2 RNA的数量大大增加（图5c）。然而作为低钾耐受型的NC89，在两个处理中并没有观察到显著的NR活性变化。这说明了对K+缺乏敏感型烟草在处理初期通过NR途径诱导NO含量增加。/图5两烟草品种的NR活性和qRT-PCR分析3.3.5外源添加NO供体和NO清除剂影响一级侧根伸长我们研究了烟草一级侧根的延伸过程中，应用(I)NO供体SNP，(II)NO清除剂cPITO，(III)NOS抑制剂L-NAME，及(IV)硝酸还原酶抑制剂钨酸盐以确定是否增加NO水平（因缺钾导致），从而影响烟草根系形态地下的变化（图6-7）。/图6NC89烟草的NO积累情况/图7NC89烟草的NO积累情况在NC89种里，SNP浓度显著≥7.5µm一级侧根长度减小（图8S1）。而在云烟1号中，一级侧根长度减小，在1.25–10µM SNP处理下和在2.5µM SNP处理下，一级侧根长度减小的水平和K+缺乏处理下的根长水平相似（图8S2）。/图8 NC89幼苗在营养液中正常的营养生长（CK）和缺钾处理（LK）或无SNP（NO供体）14天。NO供体SNP对根系发育的影响（a）和NO积累（b）。/图9 云烟1号幼苗在营养液中正常的营养生长（CK）和缺钾处理（LK）或无SNP（NO供体）14天。NO供体SNP对根系发育的影响（a）和NO积累（b）。因此，两SNP浓度（7.5µm，2.5µm，NC89。云烟1号）被用于随后的分析。SNP显著诱导NO积累和减少两个烟草品种一级侧根长度。此外，在云烟1号中，SNP的应用影响NO积累一级侧根的平均长度，和受到钾胁迫时具有类似水平。两个水稻品种，通过cPTIO、L-NAME的应用，或钨酸盐明显减少NO积累和增加一级侧根长度，与SNP的应用完全相反。因此，当受到低钾胁迫时，根系内增加NO与一级侧根的伸长率有密切关系。4.讨论钾是植物生长的主要限制因子，作物常遭受缺钾胁迫。在低输入农作系统中，鉴定作物品种的耐盐性和钾的高效利用仍然是植物科学家的一个重要使命。在这项研究中，在低钾胁迫的情况下，两个烟草基因型表现出不同的生长特征。在正常的营养比较，LK耐受的品种（NC89）保持LK胁迫下植株地上部和根系的生长14天，而LK敏感品种（云烟1号）生物量的积累被抑制了约44%。如预期LK胁迫下，两个品种的烟草植株都表现出生长迟缓，生长速率下降，但是和云烟1号相比，NC89仍然保持着较高的干重。此外，NC89的根系保持有更多的分支，同时根系内钾的含量也更高。这与在两个西瓜品种上的研究成果相一致[7]。在不同的植物物种中，KUP/HAK/KT转运体和内向K+通道（AKT1）都被报告为高亲和力钾转运蛋白和钾通道，参与LK胁迫下K+吸收。[8][9].有报道称，很多植物在LK胁迫下，KUP/HAK/KT一族的表达数量增加[10]杨等人（2014）发现，在24 h内去除K +，会引起OsHAK5的表达的大量增加，而不明显影响或延长水稻根。这与Okada等人的结果一致。我们还发现，在两种烟草的根系中，受到LK胁迫下，相对表达的两个高亲和力K+转运体（HAK1 and HKT）和一个假定的内向K+通道（NKT1)）下降了。有趣的是，与对照烟草相比，两个高亲和力K+转运体的表达水平上，NV89高于云烟1号。类似的结果已被报道，在LK胁迫下，耐受型的小麦的一种K+高亲和力的基因表达上调，而敏感型小麦则没有[11]。这可能可以解释为何在低钾胁迫下，耐受型植物体内K+的浓度大于敏感型。根是植物用来检测外界营养是否缺乏的重要器官，所以植物的根系对营养缺乏的反应能力是植物能否适应环境的关键要素。由于K+是植物根细胞内的主要渗透阳离子，因此可以合理推测，K+缺乏会抑制植物根系生长[12]。.然而，K+缺乏从而抑制根系生长的机制需要更多的调查。在对模式植物拟南芥的研究过程中，Kellermeier[13]提出了植物应对低钾情况下的两种极端方式，一种是主根生长保持不变，但是侧根的生长受到很大程度的抑制，另一种是停止主根的生长，促进侧根的生长。烟草，作为世界范围内的一种重要的经济作物，其根的结构不同于大多数双子叶植物。由于主根的不发达，烟草通过大量的侧根生长来弥补主根不发达的缺陷，在LK敏感型的根系中，受到低K+胁迫的时候，主要是通过抑制一级次根的形成和伸长从而间接表现出对植物生长的抑制作用。而不是通过抑制二级次根的形成和伸长。这一点在另一种烟草品种的研究中也表现一致。这些结果表明，烟草根系形态适应低K+的策略是停止一级次根伸长，但保持二级次根的正常生长。越来越多的表明，拟南芥根系对低钾离子的响应和生长素和乙烯有关。我们以前的研究结果表明，K+缺乏情况下烟草植物通过生长素分布的转移来达到抑制一级次根的伸长的目的。除了上述两种植物激素，已被报道称，NO作为一种信号分子，当植物遭受营养元素匮乏时候对根系的发育的启调控作用[14]。.对各种植物研究表明，NO和植物激素，如生长素和乙烯之间存在相互作用。对云烟1号使用2.5 μM SNP，达到和LK胁迫下相似的NO水平时,会受到使用cPTIO的强烈抑制。除此之外，SNP的使用会使CYCB1;1的表达下降，根分生组织内细胞周期活性的标记基因表明NO在在调控干细胞决定的重要作用。Fernández-Marco[15]在这项研究中，我们还发现，NO可能参与生长素调节一级侧根伸长，作为对低钾胁迫回应。这些说明，由低钾诱导的NO积累可能与一级侧根的伸长成正相关关系。硝酸还原酶和一个假定的NOS酶代表植物中NO产生的潜在酶源[16]，由研究称，NR涉及NO作为响应生物和非生物胁迫的生产过程。.在本实验，在根系中观察到当缺钾的时候，云烟1号根系中NR活性增强程度大于NC89，随后慢慢下降。虽然NOS蛋白尚未在植物体内被证实[17]。但是动物NOS抑制剂（L-NAME）抑制低钾胁迫下云烟1号体内NO的积累，从而诱导烟草根伸长。提示一氧化氮合酶途径可能参与了NO诱导的NO生成。总而言之，两个品种的烟草在在低钾胁迫下表现出了不同的生长特征，LK耐受型NC89和LK敏感型云烟一号相比，在根系中和叶片中都积累了较高浓度的K+。此外，研究表明，NO作为信号分子，通过抑制一阶侧根的伸长从而实现植物度LK胁迫的响应。5.参考文献1.Schroeder JI, Ward JM, Gassmann W (1994) Perspectives on the physiology and structure of inward-rectifying K+ channels in higher plants: biophysical implications for K+ uptake. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1.简介1
2.材料和测定方法2
2.2.1植物生长3
2.2.2根系结构记录4
2.2.3钾浓度测定4
2.2.4根尖NO含量的测定4
2.2.5硝酸还原酶（NR）活性测定4
2.2.6 qRTPCR分析4
2.2.7数据分析5
3.结果5
3.3.1两个品种烟草对钾缺乏的反应的不同5
3.3.2缺钾抑制云烟一号的一级侧根的生长和延长7
3.3.3缺钾使云烟1号中NO含量增加，而NC89则不增加7
3.3.4低钾情况下通过硝酸还原酶途径诱导NO含量增加8
3.3.5外源添加NO供体和NO清除剂影响一级侧根伸长9
3.3.6生长素介导产生的NO也可以在缺钾下抑制一级侧根伸长10
4.讨论11
5.参考文献12
资环院学生周中铭
一氧化氮参与钾胁迫对烟草根系生长影响
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/hxycl/zyyhj/560902.html
