【目的】研究紫锥菊同源四倍体诱导的秋水仙素浓度和处理时间的适宜组合，并快速鉴定，创制紫锥菊同源四倍体种质，为后续研究及进一步开展紫锥菊育种工作奠定基础。【方法】采用正交设计方案优化紫锥菊无菌体系，以紫锥菊顶芽为外植体进行同源四倍体离体诱导，采用形态鉴别、根尖染色体鉴定分析相结合的方法进行同源四倍体鉴定。【结果】经诱导获得的变异体植株与紫锥菊二倍体植株有明显的形态差异，经鉴定可确定为紫锥菊同源四倍体。【结论】紫锥菊种子最适消毒方案为分别用75%酒精、0.1%HgCl2处理30s、6min,种子发芽率达58.89%；适宜生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+2.0g活性炭，平均生根率达68.33%左右；诱导紫锥菊同源四倍体的理想条件为0.05%的秋水仙素处理36h，诱导率可高达33.33%。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.2试验方法 4
1.2.1紫锥菊无菌体系的建立4
1.2.2紫锥菊无菌苗生根培养基的筛选优化4
1.2.3紫锥菊同源四倍体的离体诱导条件的优化4
1.2.4紫锥菊同源四倍体的鉴定4
2结果与分析4
2.1紫锥菊无菌体系的建立4
2.2紫锥菊无菌苗生根培养基的筛选优化5
2.3紫锥菊同源四倍体离体诱导条件的优化6
2.4紫锥菊同源四倍体的鉴定7
2．4．1 形态鉴别结果7
2．4．2 根尖鉴别结果8
3讨论8
3.1紫锥菊无菌体系的建立8
3.2紫锥菊无菌苗生根9
3.3紫锥菊诱导方案的筛选10
3.4紫锥菊同源四倍体的鉴定10
致谢10
参考文献11
紫锥菊同源四倍体种质的诱导与鉴定
引言
引言
松果菊是原产于美洲的一类菊科多年生草本，其中药用价值最大的当属 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
紫锥菊[13]Echinacea purpurea (Linn.) Moench，其提取物具有良好的免疫活性、抗炎、抗病毒及抗肿瘤活性[48]，紫锥菊是近代在国际上受到普遍重视的免疫促进剂和免疫调节剂[910]，在欧美被广泛应用在感冒、上呼吸道感染、细菌感染、昆虫及蛇咬伤等方面[1112]，紫锥菊具有类抗生素的作用。除供人类临床药用外，该植物还可以作为饲料添加剂应用[13]，以减少抗生素的用量。目前国内北京、上海、安徽、湖南、山东等地都有规模栽培[14]。不同产地生产的紫锥菊质量差别较大，其提取物含量极不稳定[15]，严重影响了紫锥菊规范化生产发展，进而延缓了药剂合成以及新产品开发。因此，建立紫锥菊无菌快繁体系，培育出性状优良、质量稳定的优良紫锥菊新种质，是实现紫锥菊规模化、规范化生产所迫切需要解决的问题。多倍体育种是药用植物优良品种的重要选育手段[1617]。在多倍体植物中染色体的数目变化常导致形态、生理等遗传特性的变异，一般具有根茎叶的巨大型、抗逆性增强、次生代谢含量增高等特点[18]。本试验以紫锥菊的种子为外植体，建立组培无菌系，对其顶芽用秋水仙素溶液进行诱导，创制出同源四倍体种质，为后续研究及进一步开展紫锥菊育种工作奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
由大学园艺学院向增旭副教授提供紫锥菊Echinacea purpurea (Linn.) Moench种子。
1．2 实验方法
1．2．1 紫锥菊无菌体系的建立
选取无虫眼、颗粒完整饱满、在水中不漂浮的的紫锥菊种子，先用10mg/L的赤霉素（GA3）浸泡24h，然后用洗衣粉洗3遍，以清洗附着在外植体上的灰尘或细菌，然后用流动的清水冲洗20至30min，放置在超净工作台进行灭菌。用75%酒精浸泡30s和40s，以及用0.1%HgCl2对外植体进行灭菌处理5、6、7min，无菌水冲洗3至4次，接种到MS（Murashige and Skoog medium）培养基上，每瓶接种外植体6个，每个编号小组10瓶，3个重复。放在25±2℃且避光的培养室中进行培养。两周后，统计外植体的发芽情况。
本试验在大学园艺学院向增旭副教授的组织培养实验室进行。培养条件如下：培养基PH为5.85、温度25℃±2℃、光照强度1500~2000Lx,光照时间12h/d、相对湿度70%~80%，定期用高锰酸钾及紫外光灯对实验操作室及培养室进行密闭熏蒸消毒杀菌。数据处理均采用IBM SPSS Statistics.进行分析，统计模型为Duncan方差分析及多重比较。
1．2．2 无菌苗生根培养基的筛选优化
选取生长健壮、长势较为一致的紫锥菊无菌组培苗，分别接种到如表2所示的添加了不同激素种类和浓度的生根培养基中进行生根培养，每试验处理20个无菌苗，3次重复。20天后，统计生根情况。
1．2．3 紫锥菊同源四倍体离体诱导条件的优化
采用0.22um的水系微孔滤头和20ml的注射器对不同浓度的秋水仙素溶液进行过滤灭菌。将紫锥菊无菌顶芽浸泡在如表3所示不同浓度秋水仙素溶液中处理相应时间，用无菌水清洗3至4次，无菌滤纸吸干附着在表面的水分后接入MS培养基，待其生长正常后转接至适宜生根培养基。每个试验处理20个顶芽，3次重复。
1．2．4 紫锥菊同源四倍体的鉴定
早上8~9点取二倍体和外形变异较显著的紫锥菊1cm根，在蒸馏水中冲洗3次后置于冰水混合物中，放到4℃冰箱中处理24小时以上。采用卡诺氏固定液（现用现配，无水乙醇：冰醋酸=3：1）进行固定6至8h。材料若不及时用,可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次,再换入70%酒精中,置于冰箱4℃保存备用。将固定后的根尖用蒸馏水清洗3至4次，加入1mol/L的HCl溶液,在60℃水浴下水解15min。制片时,取一根尖放在洁净的载玻片上,用刀片切取1mm左右的生长区,其余部分舍弃,加半滴至一滴改良苯酚品红染色液，加盖玻片，染色20min，用镊子在材料的地方轻压几下,使生长区的细胞分散开来,再在盖玻片上覆盖一层吸水纸,用铅笔上的橡皮头敲击根尖部位,重复几次，直至肉眼不可见。将制好的标本片,置于显微镜下观察，先低倍观察,选取分裂中期的典型细胞（可较清楚地对根尖细胞染色体进行计数）,换用高倍镜观察。

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