老鸦瓣 Tulipa edulis ( Miq. ) Baker 为百合科郁金香属多年生草本药用植物。根据前期老鸦瓣芽茎形成过程的转录组注释信息，发现其中 MYB 家族转录因子高度富集。为探究MYB转录因子对老鸦瓣芽茎生长发育的影响，本研究通过序列比对，筛选16个基因通过荧光定量测定其相对表达量以及在T1、T2时期的变化趋势。qRT-PCR实验结果显示其中有14个基因在T1、T2时期相对表达量呈下降趋势，4个基因在T1、T2时期相对表达量呈上升趋势。由此推测这4个 MYB 转录基因可能对老鸦瓣芽茎发育具有影响。本研究为进一步解析这4个基因在老鸦瓣芽茎生长发育过程中的作用提供了研究基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1.实验材料 2
1.1.2实验仪器 2
1.2方法 3
1.2.1筛选基因3
1.2.2提取总RNA3
1.2.3合成cDNA3
1.2.4 qRTPCR验证3
1.2.5 数据分析4
2结果与分析5
2.1总RNA提取5
2.2基因的 qRTPCR 表达量分析5
3讨论 7
3.1地下茎生长发育受多种因子调控7
3.2 MYB转录因子调控作用8
致谢8
参考文献9
qPCR验证影响老鸦瓣生长发育的MYB转录因子
引言
老鸦瓣 Tulipa edulis ( Miq. ) Baker 属于百合科郁金香属，是一种多年生草本药用植物[1]。常用中药光慈姑来源于老鸦瓣去除绒毛的干燥鳞茎。光慈姑其味甘、辛，性寒，有小毒，具有清热解毒、散结消肿的功效，主治咽喉肿痛、瘰疬结核、瘀滞疼痛、痈疖肿毒、蛇虫咬伤等症[2]。现代学者所进行的相关药理实验研究也表明老鸦瓣的提取物能够促进肿瘤细胞的凋亡，具有抗肿瘤、抗痛风等多种现代应用[3]。光慈姑作为一种现代中医用以治疗癌症的药物，近年来的临床用量逐年上升。也因这一重要的应 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
用，老鸦瓣受到了学术界、商界及中医临床的广泛关注[4]。
近年来，市场对老鸦瓣的需求量日益增加，但是老鸦瓣的繁殖率低，而野生自然资源因为药农不正确的开发或采集方式而呈逐渐下降趋势[5]。人们越来越注重于如何保护老鸦瓣野生自然资源、提高栽培产量。而人工栽培、调整开采方式、寻找新药源等方法也成为当前解决老鸦瓣资源短缺问题的重要途径。经过前期的研究，我们对老鸦瓣生长繁育特性有了深入的了解。相对于运用有性繁殖方式繁殖，无性繁殖对老鸦瓣人工栽培有更为重大的意义。
前期研究发现在1月底2月初，生长年限较短的老鸦瓣从鳞茎盘的侧面形成1至4条地下茎状结构，而芽茎是影响老鸦瓣繁殖系数的主要因素[6]。
老鸦瓣为中生型早春短命植物，在群落中对资源的竞争能力较弱，其芽茎的形成可能是其生态适应性表现之一：通过芽茎的运动寻求更适宜的生存环境，在较短的时间内实现自我扩张，得到更多的生长资源和生殖机会。因此，老鸦瓣的芽茎不但作为重要的繁殖体，对于老鸦瓣快速繁育具有重要作用，而且芽茎本身也可作为老鸦瓣物种进化和生态适应等方面研究的重要实验材料。因此，对老鸦瓣芽茎进行深入发育特征研究并探索其形成机制有重要的理论和实践意义。
在课题组的前期研究中，运用二代转录组测序技术对老鸦瓣芽茎生长发育三个时期的转录组进行测序，得到大量原始数据，再运用数据库对差异基因进行注释，功能注释显示这些基因参与老鸦瓣芽茎发育的诸多生理生化过程。
根据老鸦瓣芽茎形成过程的转录组注释信息，筛选可能与老鸦瓣芽茎形成有关的转录因子。结果发现在老鸦瓣芽茎形成过程中，涉及到723个转录因子，其中MYB家族转录因子高度富集，占比达到11.76%，且其中16个MYB转录因子在芽茎形成过程中显著上调。鉴于MYB转录因子在调控植物生长发育中具有重要调节作用，因而提出假设：这些差异表达的MYB转录因子可能在老鸦瓣芽茎发生过程中发挥重要作用。因此，拟从MYB家族转录因子入手，研究MYB转录因子在老鸦瓣芽茎形成过程中的生物学功能，探索其调控芽茎形成的分子机制。验证老鸦瓣生长发育的MYB转录因子对解决此问题具有重要的指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
实验材料采自于大学药用植物种质圃，经大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为老鸦瓣 Tulipa edulis ( Miq. ) Baker 。根据老鸦瓣芽茎生长发育特征，将老鸦瓣芽茎发育分为3个时期，每个时期均设3个重复，3个时期老鸦瓣芽茎生长发育特征如下。
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图1 T1、T2、T3时期老鸦瓣芽茎
老鸦瓣芽茎发育初期时，茎基部乳白色，平整圆滑，无凸出部分；老鸦瓣芽茎发育中期，茎基部仍显乳白色，有明显突出部分，体积膨大；芽茎发育后期，茎基部突出部分体积增大，呈乳白色、长圆柱形，圆柱形突出部分表面平整。
1.1.2 实验仪器
ABI StepOne RealTime PCR仪（购自美国ABI公司）；PTC200 PCR仪（购自美国Alpha公司）；植物RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）、定量用反转录试剂盒（PrimeScript™RT reagent KitwithgDNA Eraser)、荧光定量试剂盒(SYBR®Premix Ex TaqTMTli RNaseH Plus)；寡核苷酸引物委托上海生工生物工程技术有限公司进行合成。
1.2 方法
1.2.1 筛选基因
从转录组基因数据库（SSR2177458）中进行搜索经过SwissPort、NR注释为MYB family 或MYBrelate family 的基因126个，根据基因ID检索出其在T1、T2、T3三个时期的RPKM值，去除三个时期的RPKM值小于2的基因，将RPKM值均一化，进一步绘制聚类热图，以此筛选出T1至T2时期上调的基因25个。RPKM值（Reads per kilo basers per million reads）法，是指每一百万读长中同一基因每一千碱基长度的读长数。最常用的估算目标基因表达水平。以基因ID搜索每个基因的氨基酸序列和碱基序列。将氨基酸序列的文档提交至hmmer https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer，经过与MYB结构域hmm模型比对，有13个基因具有典型结构域（PF00249 myb DNAbinding）。同时将这多个基因氨基酸序列提交至MEME（http://memesuite.org/），16个检测出具有超二级结构。基于转录组的MYB家族基因的鉴定与分析，筛选出含有R2R3结构域基序，存在于所有具有全长的R2R3MYB蛋白，和存在于所有具有全长的MYB家族蛋白。两者结合，筛选出目的基因，采用荧光定量PCR验证其在T1、T2的表达量。

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