为了获得可溶性高活性高的PPO蛋白，本文选用茶树品种“迎霜”鲜叶为材料，克隆出茶树CsPPO基因。经过BLAST比对，确定第43个氨基酸为转移肽并切除，分别与pET32a载体、pMAL-c5X构建重组原核载体。利用E.coil Transetta(DE3)菌株进行表达，经SDS-PAGE电泳检验，pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取，大量出现在上清液中；而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中。利用邻苯二酚和EC两种底物在410 nm处检测茶树CsPPO蛋白活性结果表明，pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显‘S’型变化，表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程。其中pMALc5X-CsPPO43与EC反应时酶比活力最高，最大比活力为1.45×106 U·mg-1。因此，可利用pMALc5X-CsPPO43合成工业用PPO，为进一步研究其与儿茶素的反应机理，利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1.绪论1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 试验材料2
1.1.2 试验试剂2
1.1.3 试验仪器2
1.2 试验方法2
1.2.1 茶树CsPPO基因的克隆2
1.2.2 茶树CsPPO转移肽的位置的确定3
1.2.3 茶树CsPPO原核表达载体构建3
1.2.4 茶树CsPPO的原核表达3
1.2.5 CsPPO酶活性测定3
2 结果与分析4
2.1 CsPPO基因全长cDNA克隆4
2.2 CsPPO基因转移肽序列的确定4
2.3 CsPPO原核表达载体的构建4
2.4 CsPPO重组蛋白的原核表达5
2.5 CsPPO酶活性测定7
2.5.1 蛋白浓度测定7
2.5.2 以邻苯二酚为底物CsPPO酶活性测定8
2.5.3 以EC为底物CsPPO酶活性测定9
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
/> 3 讨论10
致谢11
参考文献11
茶树多酚氧化酶的原核表达及酶活性测定
引言
多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是由细胞核基因编码的铜结合蛋白，同时是一种在自然界中普遍存在的氧化还原酶。早在1883年，日本科学家Yoghid发现漆树的某种活性物质能够使其汁液变硬，而1938年Keilin和Mann则首次从蘑菇中分离纯化出了多酚氧化酶，并命名为polyphenol oxidase。自此，多酚氧化酶就一直成为研究的热点[1]。
PPO通过激活转录和诱导从头合成酶产生防御蛋白，对组织损伤产生反应，参与伤害防御[2]PPO能催化多酚类氧化成醌类，在生物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起关键的作用；PPO不仅在植物生长发育过程中有着重要的作用，而且在工业生产上也是有着非常重要的作用。茶黄素是红茶加工中产生的重要色素，是由儿茶素物质如LEC、LEGC、LECG、LEGCG等经PPO氧化生成，因其具有抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗突变、抗衰老、抗癌防癌等方面的作用；因此，对多酚氧化酶的研究具有巨大的理论和应用价值[3]。
茶黄素的体外酶促合成法是获取茶黄素的重要方法之一，但是茶黄素的体外酶促合成效率不高，这与PPO酶活性的不稳定性和复杂的反应机理有关。茶叶的品种、生长条件、土壤性质或水质均可能也对酶活的活性产生一定程度的影响[8]。茶树体内有较多PPO同工酶，有2～10条[4]，而且不同提取方法得到的茶树PPO同工酶也有差异[5]。合成茶黄素利用提取茶树体内的粗酶是混合酶，不能提供稳定单一的酶源。因此寻找合适稳定的PPO酶来源非常重要。如何从体外获取高活性单一PPO酶源越来越受到研究者的关注。
原核表达系统现今研究较为成熟[9, 10]，但是目前通过基因工程获得PPO酶活性低。研究表明原核表达得到的PPO易形成包涵体，使酶活性降低[814]。因此，本研究以茶树品种“迎霜”的鲜叶为研究材料，尝试利用可溶性较大载体pMALc5X，在不破坏酶本身活性的前提下，探索如何获取可溶性高，酶活力高的PPO。为进一步的深入了解多酚氧化酶的功能研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
本研究所用的材料为茶树品种“迎霜”鲜叶，2017年4月3日采摘于大学茶叶研究所试验基地。取样立即放入液氮中冷冻，后置于80℃冰箱保存。
1.1.2 试验试剂
pEASYBlunt Simple克隆载体、Trans1T1 克隆感受态细胞购于南京百斯凯科技有限公司。超快新型植物RNA提取试剂盒购自北京华越洋公司。DNA Marker、反转录试剂盒Prime Script® 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、5× Prime STAR HS Buffer、Mixture dNTP Mixture、RNA 酶抑制剂和MmLV 反转录酶均购于TaKaRa公司。E. Z. N. A.TM Gel Extraction Kit D2500购自OMEGA公司。引物的合成和DNA片段的测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.1.3 试验仪器
电子天平(METTLER，瑞士)，酶标仪Thermo (MK3, Multiskan, Helsinki, FI)，普通梯度PCR仪(Biorad，美国；TaKaRa，日本)，凝胶成像系统(Sensi Capture，中国)，核酸蛋白分析仪(Eppendorf，德国)，超净工作台(SWCJ1FD单人单面，苏州净化)，恒温摇床(TS200B，上海天呈)、蒸汽灭菌器(LDZX30KBS、上海申安)，电热恒温干燥箱(DHG9076A，上海精宏)，凝胶成像系统(Universal Mutation Detection System)，高速冷冻离心机(Eppendorf 5810R)，电泳仪(北京六一DYY12)，制冰机(上海安亭科学仪器厂) ，微波炉(广东美的厨房电器制造有限公司)。酶标仪Thermo (MK3, Multiskan, Helsinki, FI)，电泳仪电源（DYY6D型，北京市六一仪器厂）, 水平电泳槽（DYCP31DN型，北京市六一仪器厂）
1.2 试验方法

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