目录
摘 要 I
ABSTRACT II
第一章 文献综述 2
1 概述 2
2 Smsd4基因结构 3
3 SMAD4蛋白结构 3
4 转录因子SMAD4 3
5 SMAD4在生殖系统中的作用 4
5.1 SMAD4在卵巢中的作用 4
5.2 SMAD4在睾丸中的作用 4
5.3 SMAD4在子宫中的作用 5
5.4 SMAD4与家畜繁殖力的关系 5
第二章 猪SMAD4基因启动子区鉴定与分析 6
1 材料与方法 6
1.1 试验动物 6
1.3 生物信息学软件与在线分析网站 7
1.2.1 生物信息学软件 7
1.2.2 在线分析网站 7
1.4 试验方法 7
1.3.1 总RNA提取 7
1.3.2 KGN细胞培养 7
1.3.3 cDNA 末端快速扩增（RACE） 7
1.3.4 猪耳样采集与基因组DNA提取 8
1.3.5 PCR扩增和测序 9
1.3.6 缺失表达载体构建 9
1.3.6 细胞转染 9
1.3.7 双荧光素酶活性分析 9
1.3.8 生物信息学分析 10
1.3.9 统计分析 10
2 结果与分析 10
2.1 猪SMAD4基因转录起始位点鉴定和分析 10
2.1.1 猪SMAD4基因转录起始位点鉴定 10
2.1.2 猪SMAD4基因5UTR序列分析 11
2.2猪SMAD4基因启动子区序列扩增和分析 12
2.2.1 猪SMAD4基因启动子区序列扩增 12
2.2.2 猪SMAD4基因启动子区序列分析 12
2.3 猪SMAD4基因核心启动子区鉴定 13
2.3.1 猪SMAD4基因核心启动子区预测 13
2.3.2 猪SMAD4基因启动子区缺失表达载体的构建 14
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3.3 猪SMAD4基因核心启动子区鉴定 15
2.4 猪SMAD4基因核心启动子区序列分析 16
2.4.1 核苷酸序列分析 16
3 讨论 17
第三章 结论与展望 19
1 全文结论 19
2 创新点与展望 19
参考文献 21
致 谢 27
猪SMAD4基因核心启动子区鉴定与分析
摘 要
SMAD4基因作为SMADs蛋白家族的核心成员之一，在哺乳动物体内的多个生理和病理过程中均发挥着关键作用。研究发现SMAD4和哺乳动物卵巢卵泡发育有着密切关系，其在卵泡中的表达水平与排卵数呈显著正相关，是影响哺乳动物雌性生殖的关键基因。实验室前期研究证实SMAD4是猪卵泡发育、闭锁以及颗粒细胞增殖和凋亡的重要调节因子，且其3′UTR受促凋亡因子miR26b的直接调节。但猪SMAD4基因5′调控区的研究还未见报道。本研究拟采用5′RACE技术鉴定猪卵巢中SMAD4基因的转录起始位点（TSS），分析5′UTR序列特征；采用缺失表达载体和荧光素酶活性分析技术鉴定猪卵巢中SMAD4基因的核心启动子区，利用生物信息学方法分析核心启动子区序列特征。结果发现猪卵巢中SMAD4基因的转录起始位点（TSS）位于起始密码子（ATG）前115 nt处，5′UTR序列长度为115 bp，含有GRE经典元件。通过PCR扩增测序获得了1923 bp猪SMAD4基因启动子序列，并成功构建4个缺失表达载体p1957（1923/+34）、p1152（1118/+34）、p649（615/+34）、p304（270/+34）和p120（86/+34）。荧光素酶活性分析发现p120载体的荧光素酶活性极显著高于对照组和其他载体，说明猪卵巢中SMAD4核心启动子区位于86 nt ~ 1 nt之间。生物信息学分析发现猪SMAD4核心启动子区含有多个顺式作用元件，如SOX10、GATA1、OTX2和PITX1等转录因子结合位点，和miR144、miR361、miR506和miR890等miRNA结合位点。总之，本文鉴定了猪卵巢中SMAD4基因的转录起始位点和核心启动子区，为SMAD4基因转录调控的研究奠定前期的理论基础。

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