花青苷广泛存在于自然界的各种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、预防心血管疾病、预防肥胖和缓解糖尿病等作用。花青苷的结构基因的表达受这三种转录因子MYB、bHLH和WD40组成的复合物的调控。同时，植物中花青苷的合成代谢也受内在因素和外部环境的影响。本研究选取了两个不同品种的绿豆，研究其幼茎上与花青苷合成相关的关键基因，找出两者的差异基因并分析，尤其是两者调控基因的区别及其相互作用，以期进一步加深对绿豆中的花青苷合成调控的理解。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1花青苷含量的测定2
1.2.2提取RNA2
1.2.3合成cDNA第一链3
1.2.4定量反转录多聚酶链式反应（qRTPCR）3
2 结果与分析3
2.1花青苷含量3
2.2调控基因分析5
2.2.1 转录因子MYB 5
2.2.2转录因子WD40蛋白6
2.2.3转录因子bHLH蛋白7
2.3 结构基因分析9讨论10
致谢10
参考文献11
调控绿豆胚轴花青苷合成的分子机制
引言
赋予水果、蔬菜和花卉颜色的化合物一直是人们的研究兴趣所在，因为它们具有吸引人的色素沉着、作为天然食用色素的潜力，对人类的健康有益[1]。花青苷是形成植物颜色的主要作用色素之一，具有水溶性的特性，无毒可食用，花青苷是位于植物体内的一大类次生型代谢产物，统称为类黄酮[1]。花青苷作为一种具有极高活性的黄酮类多酚物质，存在于自然界的各种植物中，日常常见于植物的有颜色反应的花瓣中、果实的组织中及植物的茎和叶的表皮细胞与下表皮层。花青苷不仅化学结构多种多样，并且品种数量也很多，自然界中最常见的花青苷品种类型包括天竺葵色素（Pelargonidin）、矢车菊色素（Cyanidin）、芍药色素（Peonidin）、飞燕草素（Delphinidin）、矮牵牛色素（Petunidin）及锦葵色素（M *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
alvidin）6种非配糖体（Aglycone）[2]，其中，矢车菊色素是最常见的花青苷。
目前已经有众多研究表明，花青苷有着很大的生理价值，具有抗氧化、抗菌、抗炎的特性，同时还能抗癌、预防肥胖、预防心血管疾病，具有缓解糖尿病等作用[3]。
植物体在其代谢过程中会产生大量的能量（ATP）和氧自由基，植物细胞容易被氧自由基破坏，从而导致其内部的生物膜结构中的脂质发生变性、老化和破裂的现象。由于花青苷中含有大量的活性羟基，因此它们具有很强的抗氧化性并且能够清除自由基。在人体内的肿瘤形成的初始阶段，花青苷能够诱导早期癌细胞进行分化并促进肿瘤细胞中有丝分裂末端进行分化，从而抑制人体内的恶性肿瘤的产生，所以花青苷可以阻止癌细胞的连续增殖和分裂过程。在人体内的肿瘤的生长阶段，花青苷可以诱导癌细胞发生凋亡反应，从而抑制癌细胞由于其过度增殖而恶化形成恶性肿瘤。因此，花青苷在药物方面有着广阔的发展空间。花青苷的其他一些作用例如预防肥胖、预防心血管疾病和缓解糖尿病症状，这些作用使花青苷可以应用于保健产品。
目前为止，国内外对于花青苷的研究，选用的对象大多是苹果、胡萝卜、蓝莓、葡萄和石榴等这些花青苷含量多的植物，研究的关注点也聚焦在花青苷的产量及其着色机制上。而本实验培育两个不同品种的绿豆，选取不同时期的两种绿豆幼茎，测量花青苷含量，进行对比。从幼茎中分离出RNA，进行差异表达分析，通过定量PCR（qRTPCR）对花青苷合成过程中的相关基因进行验证。在绿豆幼茎花青苷差异的遗传基础上，利用定位群体进行定位，分析这两种绿豆中花青苷调控基因及合成途径关键基因差异。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验材料为绿豆品种“苏绿一号”和转基因品种“M0313”，首先对种子进行消毒（用10 % H2O2浸泡种子1015 min，来回颠倒几下，用去离子水冲洗干净）、发苗（将种子放入盛有滤纸的培养皿中，加入去离子水浸泡种子，放入温箱培养810 h），将发好苗的种子（见图1）移入培养土中，按时浇水。绿豆发芽后，选取早期的一个时间点开始取下胚轴的样，之后每隔12 h取一次样，最后一次加上绿豆上胚轴的样。
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图 1 发苗的绿豆
1．2 实验方法
1．2. 1 花青苷含量的测定
从子叶部位开始向下取绿豆的下胚轴，称取0.8 g新鲜的绿豆下胚轴放入8 mL 1 % HCl甲醇溶液中，在室温下，放置于黑暗环境中，浸提12 h。使用分光光度计测定提取液，测量提取液在吸光度为553和660 nm处的吸光值，二者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01定义为一个单位U。每一组设置3个重复。花青苷含量的单位最后用Ug1 FW表示。
1．2. 2 提取RNA
对绿豆幼茎的下胚轴进行采样，样品质量大致相等，取样要迅速，取出的样置于80℃的冰箱中进行保存。
用E.Z.N.A.®Plant RNA Kit Difficult Samples Protocol法提取绿豆下胚轴的RNA：（1）将存储在80℃冰箱里的样品取出，放入打样机内，用液氮快速研磨成粉末状；（2）将高达100 mg的粉末样品转移至1.5 mL离心管内；（3）立即加入500 μL的RCL缓冲液，将离心机设置为10 000 r/min，离心5 min；（4）在55°C下反应13 min；（5）在室温下，将离心机设置为10 000 r/min，离心5 min；（6）将清除后的裂解物直接转移到2 mL收集管中的gDNA过滤柱中，在室温下，将离心机设置为14 000 r/min，离心5 min；（7）流动加入相同体积的RCB缓冲液，以最大速度为20的涡流方式；（8）将HiBind®RNA迷你柱插入2 mL收集管中；（9）将700 μL样品,包括可能形成的任何沉淀物,转移到HiBind®RNA迷你柱中；（10）在室温下，将离心机设置为12 000 r/min，离心1 min；（11）丢弃滤液,重新使用收集管；（12）重复步骤（9）（11），直到所有样本都被转移到收集管里；（13）加入400 μL RWF洗涤缓冲液；（14）在室温下，将离心机设置为10 000 r/min，离心30 sec；（15）丢弃无用的滤液，收集迷你柱；（16）将HiBind®RNA迷你柱转移到一个新的2 mL收集管中；（17）加入500 μL RNA洗涤缓冲液II；（18）在室温下，将离心机设置为10 000 r/min，离心30 sec；（19）丢弃滤液，再利用收集管；（20）加入500 μL RNA洗涤缓冲液II；（21）在室温下，将离心机设置为10 000 r/min，离心30 sec；（22）丢弃滤液，再利用收集管；（23）使用离心机，以最大速度离心1分钟,使HiBind®RNA迷你柱完全干燥；（24）将HiBind®RNA微型柱转移到干净的1.5 mL离心管中；（25）加入50100 μL DEPC水；（26）使用离心机，以最大速度离心1分钟，并在70°C的环境下储存洗脱的RNA。

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