酰基转移酶主要控制蛋白质的酰化与脱酰化的催化反应，它有调节蛋白活性、使蛋白表达等功能。二相代谢酶N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase NAT)可以催化将乙酰基团从乙酰CoA 转移到它的作用底物芳香胺以及一些杂环胺类物质上，是生命体蛋白质修饰中的重要一环。本实验将粘质沙雷氏菌FS14中两个酰基转移酶基因L085_10160及L085_09570克隆至pET43a表达质粒里面，将pET43a-09570和pET43a-10160重组质粒转化到大肠杆菌C43（DE3）菌株进行异源诱导表达。经过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析之后获得了比较纯的10160蛋白，酰基转移酶10160在浓度条件0.1M 柠檬酸钠pH5.5,20% PEG4000以及0.1M 醋酸钠pH4.6,20% PEG4000的条件下长出了晶体，并收集到1.75 Å完整的衍射数据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
材料 3
1.1.1菌株及质粒3
1.1.2 培养基及溶液配方3
1.1.3 主要酶及试剂3
1.1.4 主要仪器3
1.2 方法 4
1.2.1 大肠杆菌C43中目的基因表达质粒的构建4
1.2.2 目的蛋白的表达检测6
1.2.3 500ml菌液微量蛋白的纯化6
1.2.4 3L菌液大量蛋白的纯化7
2 结果7
2.1 质粒构建8
2.1.1 引物扩增8
2.1.2 酶切结果8
2.1.3 质粒鉴定9
2.1.4 酶切鉴定9
2.1.5 测序结果9
2.2 大肠杆菌C43重组质粒表达10
2.2.1 重组质粒表达检测11
2.2.2 重组质粒表达优化12
2.3 蛋白纯化13
2.3.1 蛋白小量纯化13
2.3.2 蛋白大量纯化14
2.4 蛋白结晶条件的筛选14
2.4 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
.1蛋白结晶条件的初筛14
2.4.2蛋白结晶条件的优化16
3 讨论 21
致谢22
参考文献23
附录 24 粘质沙雷氏菌FS14中酰基转移酶（10160）和（09570）的表达纯化及结晶条件筛选
引言
沙雷氏菌作为一种非常常见的兼性厌氧的革兰氏阴性细菌。常存在于土壤和水中，它在临床医学上也同样是一种条件致病菌，当它聚集部位改变的时候，可能引起肺炎等疾病。沙雷氏菌可以产生许多种的胞外酶，在医药业、工业以及农业中都有着重要的应用。本实验所使用的粘质沙雷氏菌是从白术茎秆中分离得到的，本实验使用的沙雷氏菌菌株，它可以分泌蛋白水解酶和一些可以耐高温的DNA酶[1]。
酰基转移酶是一种可以催化很多生物体内的蛋白质的酰基化还有去酰基化的反应的酶，它在生物体中的遗传还有代谢中都起着很重要的作用，也是许多真核生物蛋白修饰的一类重要的方式。
N乙酰基转移酶它作为人体中很重要的一种二相药物代谢的相关的酶，在人体里代谢药物还有解毒方面都具有着非常重要的作用。但它的活性在不一样的个体里的差异是非常明显的，这种差异会直接影响到药物的疗效以及人体对药物毒性的反应。因此，要对于NAT的活性进行测定的话可以用它来评估乙酰化这类代谢药物在人体里面的代谢程度[2]。
N乙酰基转移酶中ARD1可以在蛋白质翻译之后对它的 N 端的α氨基或者是赖氨酸残基上的ε氨基上添加乙酰基。我们已经知道ARD1它在哺乳动物的很多种组织里面都有分布，它定位在胞浆或者是细胞核里。现在已经有人发现了它的基因和一些肿瘤的发生都有着相当密切的关系，是可以作为肿瘤治疗领域里面的一个潜在的靶标[3]。在细菌中，N乙酰转移酶能影响细菌的毒力。乙酰转移酶通过调控双组份系统影响细菌的毒力。双组份系统可以把细菌外部不利的环境条件，翻译成细胞可以识别的化学信号传递到细胞内部，这样细菌就可以通过识别还有传递外界的信号来调节自己的状态来适应环境。
细菌的耐药性也同N乙酰基转移酶的活性有关[4]。氨基糖苷这类抗生素对相当多种革兰氏阴性菌都有着相当大的杀伤的作用，而伴随着抗菌的这类药物在临床实验上的越来越广泛的应用，一些细菌对常用抗菌药物出现了不同程度的抗药性，并且它们的耐药性还越来越严重了[5]。研究表明，细菌产生抗药性是一种非常普遍的现象，产生这种现象的原因也是多种多样的[6]。
近来发现，细菌的多种修饰酶，包括比如O磷酸转移酶、O核苷转移酶还有N乙酰基转移酶等等。上面的这些可对一些抗生素的特定基团进行修饰，这些抗生素大多是氨基糖苷类的，被修饰的基团大多是氨基或羟基。这种现象的原理是被修饰之后的抗生素不能载和细胞内 的核糖体 进行结合，从而丧失了自身的 毒性[7]。伴随着生命科学研究在分子水平上的不断深入，各种生命现象也更加为人们所熟知。酰基转移酶的酰基化作用在生命现象中的重要性也必将更加被人们所重视。
本实验所研究的沙雷氏菌FS14中两个酰基转移酶10160及09570属于GNAT superfamily[8]。
研究表明，这一种类的蛋白它通常具有着组蛋白还有非组蛋白的乙酰化转移酶的功能，往往可以在细胞中饰演着多重的角色，比如说可以调控端粒酶的活性、会影响核糖体RNA它的合成还有加工、还影响组蛋白的乙酰化还有染色体的解聚等，而且还可以通过乙酰化微管蛋白来影响细胞质的分裂。随着最近这些年来人们对NAT10细胞的功能的深入研究，发现原来它在细胞中的定位还有表达的改变是和很多种肿瘤细胞的侵袭能力是有密切的相关的,它还作为早衰症一个隐藏的一个治疗的靶点, 在临床上的研究与应用价值愈发受到关注[9]。
本实验用到了分子生物学的方法，把沙雷氏菌FS14中的乙酰基转移酶（09570和10160）目的基因利用PCR扩增技术获得目的片段，将目的片段克隆到表达载体，分别转化到粘质沙雷氏菌FS14和大肠杆菌C43中进行表达，并对它的表达的产物进行了分离纯化。最后获得了有活性的纯度还较高的目的蛋白10160，而且对10160进行了结晶条件的筛选，这些为乙酰转移酶以后的晶体学研究奠定了一些基础。

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