重金属胁迫下某些植物类群可以通过表型可塑性提高种群适合度。已有研究报道，表观遗传变异可介导表型可塑性。然而目前对于重金属积累植物种群的表观遗传变异尚不清楚。为了探究植物种群应对重金属污染的表观遗传学机制，利用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）对野外采集的4个污染区滇苦菜、2个非污染区滇苦菜以及2个毛连菜的各12个个体进行研究。结果表明污染区植物甲基化程度低于非污染区植物；聚类分析将污染区植物聚为一类，非污染区植物聚为一类；2个毛连菜属植物的8个不同种群种间发生了轻度的表观遗传分化，并且表观遗传与重金属环境具有一定的相关性。研究结果暗示了植物可能通过去甲基化过程降低甲基化程度，启动相关响应基因转录表达来应对重金属环境。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言 3
1材料与方法5
1.1材料 5
1.2 DNA提取 5
1.3 MSAP分析 5
1.3.1基因组DNA酶切6
1.3.2酶切产物接头复性6
1.3.3 酶切产物接头连接6
1.3.4预扩增 7
1.3.5 选择性扩增 7
2 结果与分析8
2.1表观遗传多态性8
2.2甲基化差异8
2.3 PCA分析10
2.4 Neighborjoining分析11
2.5 AMOVA分析 11
2.6 环境因子对表观遗传的影响 12
2.7 RDA分析13
3 讨论 14
致谢15
参考文献15
不同重金属生境的滇苦菜种群表观遗传学研究
引言
引言 由于快速的城市化和工业化导致的重金属富集，我国土壤保护面临着前所未有的挑战[1]。通过实地考察等方式发现，冶炼、采矿、石化工业、电子工业等是我国土壤重金属的关键来源[2]。资料显示，在污染严重的矿山荒废地或污染相对较轻的农业用地中，土壤往往受到多种重金属的混合污染，从而给土壤的修复造成了很大阻碍[3]。 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 

土壤中的重金属对植物的影响巨大，植物以土壤为生长基质，当重金属在植物体内积累超过一定的阈值时，就会产生毒害作用，严重影响植物的生长发育[4][5]。但是，重金属污染地区也不是寸草不生。我们常常能够发现一些超积累植物，如东南景天（Sedum alfredii）等，它们都能够在污染地区良好的生长。通过对超积累植物的研究发现，它们具有多种耐受重金属的生理响应机制。植物通过在生理水平和基因水平上的变化来积极应对重金属环境，产生了一定的耐重金属性[6]。
植物是不能移动的，其必须面临各种多变环境的挑战[7]。遗传特性和表观可塑性是植物适应多变环境的两个重要机制[8]。尽管遗传和表观可塑性都各自发挥着重要的作用，但是表观可塑性可能发挥更大的作用[9]。
在过去的一段时间中，表观遗传学迅速发展。在今天，它代表了可遗传的有丝分裂甚至减数分裂的遗传变化，但碱基的排列顺序不会发生改变。植物被认为是表观遗传调控的“主人”，因为它们具有快速和可逆地改变其表观遗传状态的能力，并且还保持其稳定的“记忆”。在自然界中，固定的植物处于不利的环境条件，这阻碍了它们的生长，发育，生产力和存活。他们在分子水平上发展了复杂的机制来抵御这种压力情况。最近的研究已经阐述了应对各种非生物胁迫的应激反应机制的表观遗传调控。迄今为止，确定的几种表观遗传机制涉及DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑和小RNA（miRNA/siRNA）定向DNA甲基化等。植物广泛利用DNA甲基化作为表观遗传标记并进行组蛋白修饰以进行转录以及转录后基因沉默程序[10]。
DNA甲基化主要是指胞嘧啶的甲基化，在 DNA甲基转移酶的作用下，其中甲基的添加发生在胞嘧啶环的第5位，从而形成5甲基胞嘧啶（m5C）的过程。在所有生物体中，胞嘧啶甲基化主要在CG二核苷酸中发现；然而，在植物中，也检测到对称（CG和CHG）以及不对称（CHH）DNA甲基化的出现。研究发现，Posidonia oceanica在50 μmol Cd处理6小时下，其半甲基化比例为19.3%，内部胞嘧啶甲基化比例为11.2%，全甲基化比例为1.0%[11]。DNA甲基化在植物生长以及响应环境信号中具有重大作用，它可以调节植物内源基因的表达，可在不同的环境条件下启动不同基因的表达，以保证种群适应相应的环境。实验证明，重金属能改变植物DNA甲基化的程度，从而使其更好的适应环境[12]。
此外，DNA甲基化研究技术快速发展。（1）基于亚硫酸氢盐转化的方法，如全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）、还原型亚硫酸氢盐测序（RRBS）；（2）基于免疫沉淀的方法，如甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIPseq）、甲基化DNA结合域测序（MBDseq）；（3）基于限制酶的方法，如甲基化敏感扩增多态性（MSAP，Methylseq）[13] [14]。尽管基于亚硫酸氢盐转化测序的方法是检测甲基化修饰最有前景的方法之一，但是这些方法在植物种群水平的研究上受到限制，主要由于昂贵的实验和计算费用等[15]。相反，甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）能够在基因组上的随机限制性位点检测不同模式的甲基化，它能够评估野生种群的基因组甲基化模式，并且能够确定环境状况、表型特征和甲基化状态之间的联系，而且该技术是廉价的[16]，因此，MSAP技术被广泛应用于种群水平上生态表观遗传研究[17]。丁国华等人利用MSAP技术研究Isoetes sinensis在Pb和Cd胁迫下的DNA甲基化变化，证明了其在胁迫下甲基化程度提高[18]，该技术也适用于水稻等绝大部分植物[19]。Giovanna Mason等人也利用MSAP技术鉴定出了番茄中响应黄叶卷曲撒丁病毒的基因，因此该技术也可用于特定响应基因的筛选[20]。
汤叶涛等人在2009年报道了滇苦菜(Picris divaricata Vaniot)的超积累特性，它是一种菊科、两年生草本植物，直根，茎直立，高处于1540厘米，广泛分布在兰坪铅锌矿区草地或灌木土壤上[21] [22]。滇苦菜的近缘种毛连菜(P.hieracioides L．) 为菊科草本植物，主要分布于欧洲、亚洲和北非地区，我国主要分布有5种。科学家对于耐重金属的滇苦菜耐性的生理研究较为透彻，然而其表观遗传在植物耐性方面的研究甚少。滇苦菜是我国特有的物种，其对重金属Zn、Cd具有积累特性，然而其近缘种毛连菜不具备该种特性，因此通过研究滇苦菜的甲基化，明确其应对重金属的表观遗传学机制；此外，滇苦菜及毛连菜在中国云南省分布广泛，并且分布地域具有一定的特征（重金属污染/非污染），因此通过研究其表观遗传变异可以为研究毛连菜属的两种植物的进化关系以及滇苦菜的拓殖关系提供一定的依据。

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