本研究旨在筛选获得耐75℃的高温纤维素降解菌，并与低温、中温降解菌进行复配，研究接种复合菌株较单一菌株的区别以及不同接种方式的差异。通过CMC-刚果红培养基初筛和秸秆粉培养基复筛获得耐75℃的高效纤维素降解菌1株，采用DNS法测定该菌株酶活、16SrRNA测序法鉴定菌株，并将该菌株与低温菌DW-1和中温菌GZ-2进行分步接菌和同步接菌，设置单一菌株对照。结果表明，筛选获得的高温纤维素降解菌B-8能耐75℃高温，含有纤维素酶和半纤维素酶，培养7d后秸秆相对降解率为9.33%，经16SrRNA鉴定其为土芽孢杆菌属；复合菌株酶活变化较单一菌株稳定，其中CMC酶活随时间增长，同一时间段酶活大小为GZ-2＞DW-1＞同步接菌＞分步接菌＞B-8，各处理的FPA酶活变化差异较大，在不同时间段取得最高值；复合菌株对秸秆的降解效果高于单一菌株，摇瓶培养9 d，分步接菌和同步接菌的秸秆降解率分别为52.67%和52.33%，分步接菌的效果大于同步接菌，说明接种方式的改变会导致降解效果的差异。基于以上认为单一酶活的高低与秸秆降解率无线性关系，纤维素的降解是多种酶的协同作用，通过改变接种方式可发挥菌株优势、促进纤维素降解。本研究可为复配菌剂的研发和接种方式提供参考和借鉴。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1 样品来源及处理3
1.1.2 菌株3
1.1.3 培养基3
1.1.4 主要试剂及仪器3
1.2 实验方法 3
1.2.1高温纤维素降解菌的筛选和纯化3
1.2.2高温纤维素降解菌酶活测定4
1.2.3高温纤维素降解菌降解效果测定4
1.2.4高温纤维素降解菌株的鉴定5
1.2.5菌株复配实验5
1.2.6接种复合菌剂的酶活测定5
1.2.7接种复合菌剂的降解效果测定5
1.3数据处理5
2结果与分析5
2.1高温纤维素降解菌的筛选及纯化5
2.2高温纤维素降解菌酶活测定6 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 

2.2.1葡萄糖标准曲线的绘制6
2.2.2高温纤维素降解菌的酶活结果6
2.3高温纤维素降解菌降解效果测定6
2.4菌株鉴定结果7
2.5复配菌剂的酶活测定7
2.5.1 复配菌剂的内切葡聚糖酶（CMCase）测定7
2.5.2复配菌剂的外切葡聚糖酶（FPase）测定8
2.6复配菌剂的降解效果9
3 讨论10
3.1高温纤维素降解菌的筛选10
3.2复配菌剂的研究10
4 结论 11
致谢12
参考文献12
高温纤维素降解菌的筛选及菌剂复配研究
引言
引言
中国作为农业大国，每年农业废弃物产量巨大，其中各类农作物秸秆的每年产量大于8亿t，以东部和南部居多，如山东、四川等[1]。经大量统计，收集后的秸秆的各种用途比例如图1，其中秸秆的废弃及焚烧占了31.3%[2]，然而秸秆的废弃和焚烧会造成土地占用、环境污染等问题，通过处理可变为可利用资源，大致包含肥料化、能源化、饲料化、工业原料化和基质化五个方面[3]。目前，较为成熟的技术为堆肥，多数国家已形成一定规模，如日本卧式转筒式快速堆肥壮土、美国BIOTEC2120高温堆肥系统等，但这些工艺成本较高，中国还处于研究阶段[4]。
现代堆肥化技术是指在人工操作下，通过调控水分、C/N和通风情况等条件，利用微生物的发酵作用，使得有机固体废物变成营养物质丰富、健康无害、肥效长久稳定的有机肥料。堆肥的本质是多种微生物的共同作用，经由微生物产生的纤维素酶、木质素酶、半纤维素酶等对难降解物质进行分解。由于堆肥的物料是富含纤维素的秸秆等，而纤维素的难降解特性，会限制堆肥化速率，导致腐熟周期过长、成品质量不高等问题，在堆肥的高温阶段除了能够利用微生物有效降解有机大分子，同时能够利用高温杀死病菌、虫卵和杂草种子等，因此研究热点在于外源菌剂（有效降解纤维素的微生物）的添加及木质纤维素降解主要发生时期（高温阶段）[57]。


图1 可收集秸秆的各种用途比例
Fig1 Collection of various uses of straw
国内外学者对于常温纤维素降解菌的筛选和单一菌株对堆肥化过程的影响两方面已取得较多成果[810]，发现降解菌主要包含细菌、真菌和放线菌，而接种降解菌后可显著提高堆肥温度、缩短升温期、有效促进纤维素分解、提高堆肥品质等[1112]。常温菌在高温环境活性降低，而嗜热菌拥有有活性高、时代短、酶的热稳定性高等特点，可弥补常温菌的不足[1314]。虽然对高温菌的研究已进行多年，但大多培养温度局限于5060℃。此外，研究发现复合菌剂的降解效果明显高于单一菌株，效果更加稳定[15]，显著提高堆肥温度[16]，而且高温复合菌剂效果大于常温复合菌剂，但是目前大多局限于同一温度梯度下的菌株进行复配，无法运用到堆肥体系中。因此，本试验拟筛选获得耐75℃的高效纤维素降解菌，并模拟堆肥过程将该菌株与低温、中温菌株进行复配，研究其降解效果，为堆肥菌剂的研发提供思路。
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1样品来源及处理
堆肥样：山东省某秸秆堆积处
秸秆样：来源于南京周边农村，经过去除土壤和灰尘的步骤，将其剪成34 cm的秸秆条，用1%NaOH浸泡30 min，大量清水洗至pH中性，充分烘干。
1.1.2 菌株
DW1：低温纤维素降解真菌，为黑酵母菌（Aureobasidium pullulans），产多糖物质。
GZ2：中温纤维素降解真菌，菌落边缘为白色，中心为浅绿色，初步鉴定为丛梗孢目、青霉属、草酸青霉。
1.1.3 培养基
NA培养基：NaCl 5.0 g，牛肉粉3.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂15.0 g，去离子水1000 mL。
CMC刚果红培养基：羧甲基纤维素钠（CMCNa）2.0 g，(NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，刚果红0.2 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。

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