根表功能细菌rs2对pahs的降解特性和成膜能力【字数：7830】
urface of plants, helping plants to resist adverse environment and promote plant growth. PAHs in the rhizosphere of plants will be prevented to enter into the plants by the functional strains in the rhizosphere of plants, and also be adsorbed and then degraded. It has a great significance on reducing the risk of food contaminant. In this study, a PAH-degrading strain RS2, isolated from plant root surfaces in PAH-contaminated site, was investigated for its degradation characteristics and film forming ability. Besides, the degradation conditions of the functional strain were optimized so as to obtain the favorable degrading efficiency. The results of this study can provide an important theoretical reference for reducing the risk of crop PAHs contamination as well as enrich the pool of functional strain..Kenwords: PAHs, bacteria on root surfaces, biodegradation, bacterial biofilm, rhizosphere 随着工业化的快速发展，多环芳烃(PAHs)进入土壤并不断地积累，可对生态环境，食品安全，人类健康等方面造成很多危害[1-2]。PAHs是一种具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应的典型有机污染物代表，它可通过被植物吸收进入食物链中，从而对人类的健康造成威胁[3-4]。Song[5]等在PAHs污染土壤中种植卷心菜、洋葱、番茄和小麦等植物，发现菲和芘均可影响植物根的生长和幼苗的萌发，尤其是菲对植物的影响。Flocco[6]通过水培实验研究发现，菲对紫花苜蓿有明显的影响，使其生长降低，因为细菌总量受到叶绿素含量和根系过氧化物酶活性存在的影响而减少，而菲降解细菌的比例增加。因此，可以看出土壤中的PAHs会影响农产品安全，进而威胁人群健康，如何减低植物对PAHs的吸收和积累仍需进一步研究证明。研究发现根际细菌中存在PAHs降解功能细菌。一般来说，只有1%的微生物群落会降解烃类化合物，但在污染环境中，却有10%的菌株会降解烃类化合物[7-8]。自从Kiyohara等分离得到一株菲降解菌株以来，Rhodococcus sp.、Sphingomonas、Micrococcus sp.、Aeromonas sp.、vanbaalenii等可降解菲的菌株也相继被报道出来[9-11]。郑学昊[12]等研究了多环芳烃污染土壤的生物修复技术，并提出利用多环芳烃降解细菌降解有机污染物，目前为止报道的降解菌约有200种[13]。邓军[14]等把1株菲降解菌氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)从长期受PAHs污染的土壤中分离出来，在菲初始质量浓度为50 mg·L-1的无机盐培养液中培养5 d后，菲降解率可达60%左右。倪雪[15]等从多环芳烃污染区植物体内分离得到两株具有降解菲能力的寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，无机盐培养基中的菲(100 mg· L-1)可在7 d内被两株菌降解90%。田志刚[16]等从胜利油田附近石油污染土壤采集土样，筛选到能以菲为唯一碳源的芽孢杆菌属，培养96 h后可降解98.36%的初始浓度为200 mg·L-1的菲。Liu等[17]从PAHs污染土壤中筛选出具有降解功能的菌株Massilia sp.Pn2，该菌株在48 h内对150 mg·L-1的降解菲率可以达到95%以上。因此尝试可利用PAHs降解细菌有效减低植物对根际土壤中PAHs的吸收积累，进而减低植物PAHs污染风险值得进行深入研究。实际上，大部分的细菌都是以生物膜的形式存在于自然环境中。同时，大多数的根际细菌可形成植物的根表面上细菌生物膜。Rozgai等[18-19]研究表明只有当细菌大量聚集（如细菌生物膜）时才可表现出对污染物良好的降解性。说明生物膜对有毒有害物质，如有毒烃类物质的降解表现出很好的降解去除效果[20]。Johnsen[21]曾指出部分细菌可以在PAHs表面形成生物膜，该生物膜的形成可大幅提高植物对低水溶性PAH的利用率；又如分枝杆菌属菌株在液体培养时能够在蒽晶体表面形成生物膜，且形成生物膜的细菌生物量占总生物量的40%[22]。这充分说明，植物根际存在大量的细菌，一些细菌可以通过成膜形成植物的根表面上的细菌生物膜，起到可促进作物产量的增加，增加植物的胁迫抗性，降低植物病虫害的作用[23]。但有关可降解有机污染物的根际细菌在根表的成膜能力尚不清楚，仍有待研究。植物根际细菌在根表形成的细菌生物膜对植物中有机污染物的降解起到了促进作用，为土壤有机污染物修复提供思路。然而，关于根际细菌在根表形成的细菌生物膜如何影响植物吸收、如何影响植物对有机污染物的降解效率以及如何有效投入生产实践还有待进一步研究。基于此，本项目在实验室前期研究工作的基础上，研究根表功能细菌RS2对PAHs的降解特性和根表成膜能力，研究结果有望得出根表功能细菌RS2对PAHs的降解效果以及根表成膜的能力。从而为利用根表功能细菌减低作物PAHs污染风险提供菌种资源和理论依据。1.材料与方法1.1材料1.1.1化学试剂菲、蒽、萘、芘、苊、苯并[a]芘(≥98%)均购于Fluka公司(Neu-Ulm，德国)，菲的相对分子量为178.2，25°C纯水中溶解度为1.18 mg·L-1，辛醇-水分配系数(log Kow)为4.57(Yaws, 1999)。甲醇为高效液相色谱纯(High-performance liquid chromatography, HPLC)，其余化学试剂均为分析纯。1.1.2培养基无机盐培养基(MSM)(g·L-1)KH2PO4 0.20，(NH4)2SO4 1.50，MgSO4·7H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.91，微量元素溶液1 mL pH 7.0 ，Na2MoO4·2H2O 0.01，CoCl2·6H2O 0.1，Na2SeO4·2H2O 0.01，MnCl2·4H2O 0.425，CuSO4·5H2O 0.015，ZnCl2 0.05，NiCl2·6H2O 0.01。LB培养基(g·L-1)pH 7.0，酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，。菲降解培养基(PMM)在灭菌的三角瓶中加入一定量浓度为2 g·L-1的菲的丙酮母液，待之后在无菌无机盐培养基中加入丙酮完全挥发后的母液，最终菲的浓度为100 mg·L-1，即PMM培养基。液体培养基中加入18 g·L-1 的琼脂配置成固体培养基。1.1.3供试菌株菌株RS2，有鞭毛，呈现出短杆状，尺寸为(4 µm × 3 µm)。菌落形态颜色为淡黄色，形状为圆形，表面光滑并且边缘整齐。用灭菌毛刷将采集的植物样品轻轻去除植物根表泥土后，将其置于装有5 mL灭菌超纯水的离心管中剧烈震荡30s，以破坏根表细菌生物膜结构使细菌游离出来。取1 mL细菌悬液加入到浓度为100 mg/L的PMM中，30oC、150 r·min-1摇床培养。7 d后将5 mL富集液转接到新鲜的PMM培养基继续培养，连续进行4次转接。将最后一次富集液稀释并涂布于PMM固体平板，30oC恒温培养，待平板上长出菌落，在紫外灯下观察，挑选菌落周围出现降解暗圈的菌株，通过划线分离纯化得到单菌落。纯化后的单菌落分别置于4oC冰箱保存备用和用终浓度15%的甘油于-70oC低温保存。1.2.方法1.2.1菌株RS2对菲的降解挑取的菌株RS2的单菌落并接种于LB液体培养基，于30°C培养36-48 h，8000 r·min-1离心6 min，弃上清液后收集菌体。MSM液体培养基重悬。重复2次离心漂洗后，制作菌悬液，选用MSM液体培养基调整菌悬液OD600 nm为1.0(菌落数为2.5-5.2×108 CFU·mL-1，CFU表示菌落形成单位)，置于4oC冰箱备用。在PMM(100 mg·L-1)培养基中以5%的接种量把RS2菌悬液接种进去，30°C、180 r·min-1摇床培养，每隔4 h定时取样，测定菲的残留浓度以及细菌生长量。空白对照为以接种灭活菌悬液的PMM(100 mg·L-1)培养基，每组实验设置三次重复处理。培养液中的菲含量采用整瓶提取方法测定。将等体积的色谱甲醇加入培养基中，40kHz超声处理30 min，静置后的上清液过0.22 μm有机滤膜，利用高效液相色谱(HPLC)来测定菲浓度。HPLC参数设定流动相为甲醇:水(V:V = 90:10)，色谱柱为Inertsil ODS-SP-C18反相色谱柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)；柱温40°C；流速1 mL·min-1；进样量20 μL；检测波长245 nm。1.2.2菌株RS2对PAHs的降解广谱性向MSM培养基中加入单一PAH丙酮母液，使萘、苊、蒽、菲、芘、苯并[a]芘的初始浓度分别为100、100、50、50、20和10 mg·L-1。向菌悬液(OD600 nm = 1.0)按其5%的接种量接入，30°C、180 r·min-1摇床恒温培养，定时整瓶取样，全量提取测定培养基中PAH浓度及菌株生长量，具体操作同菲降解实验。1.2.3环境因子对菌株RS2生长和菲降解的影响采用批量试验，探讨环境因子(包括pH、温度、底物浓度)对菌株RS2的生长和菲降解特性的影响。将菌株RS2菌悬液以5%的接种量接入PMM中，分别设置不同的pH(4.0‒10.0)和温度(15‒42oC)梯度，置于30oC、150 r·min-1摇床培养。5 d后测定降解体系中菌株RS2的细菌数量和菲的残留浓度。同时，设定不同菲浓度梯度，30oC、150 r·min-1培养5 d，每6 h测定菲的残留浓度，研究不同浓度菲对菌株RS2降解菲的影响。1.2.4菌株RS2的成膜能力检测菌株成膜能力检测方法是将菌株RS2的过夜培养物分别先用无菌水稀释至OD600nm=0.3，再按照1%的接种量将其接种到含300 μL新鲜LB培养基的1.5 mL离心管中并扣紧管盖，放入30°C的恒温培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定生物膜含量。还要以同样的方法检测在PMM固体平板中生物膜的含量。然后将形成的细菌生物膜移至一新的离心管中，并用无菌水漂洗，加入 0.1 % (W/V) 400 μL的结晶紫染液染色20 min，再去掉染液，用无菌水再次漂洗两次，将已被结晶紫着色的细菌生物膜溶解于500 μL 95%的乙醇中，于590 nm波长处检测其吸光，检测菌株RS2的成膜能力。2.结果与讨论2.1菌株RS2对菲的降解动力学分析菌株RS2能够以菲作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，通过研究菌株RS2 对菲的具体降解特性，其生长和菲降解动力学曲线如图1(a)所示，无菌株RS2接种处理组（空白对照组）中菲的含量在72 h内变化较小，仅降低了9.95%，可见菲的自然损耗较小。接种菌株RS2后，发现72 h后菌株对菲的降解率高达99.98%，起初的4 h菲降解相对稳定，随着降解时间的延长，菲的降解率呈现快速增长趋势，在12 h菲的降解率达到30.25%，48 h内菲的降解率可达98.96%，48 h后菲的降解缓慢，引起该现象的原因可能是降解初期菌株的数量较少并且不能迅速适应这种不良的外界环境。后来随着菌株数量的增多和对菲适应性的提高，菌株RS2快速大量的降解菲，使得菲的降解率急剧增加，但是随着菲浓度的降低，降解速度减慢，折线趋于水平，最终菲的含量极低。细菌生物量曲线随着时间的增长先变多，再趋于稳定，最后又减少。说明菌株RS2可以菲作为唯一碳源进行生长繁殖。细菌生物量的初始值和最大值分别为6.45 log CFU·mL-1和7.43 log CFU·mL-1。培养初期，菌株RS2的细菌生物量较少，可能是由于菌株RS2所处的PMM培养基中菲的初始浓度较高，毒性较大不适合其生长，对功能菌株造成一定的胁迫。在培养0-54 h时，菌株的适应性提高，菌株开始利用底物菲，使菌株数量迅速增多；28 h后，由于碳源开始减少，菌株数量趋于稳定；54 h的时候达到最大细菌生物量7.71 log CFU·mL-1，54 h后，由于碳源缺乏，细菌因摄取不到足以维持生长繁殖的碳源，细菌数量开始逐渐减少。此外，降解过程中菌株RS2还可能受到产物的反馈抑制，比如1-羟基-2-萘甲酸。1-羟基-2-萘甲酸被认定为微生物修复PAHs污染过程中最易积累的一种含氧多环芳烃中间产物，其对大多微生物有较强毒性[24]，可导致菌体数量下降。综上，利用功能菌降解环境中的PAHs时，需保证菌株数量不能过低，以免影响功能菌对PAHs的降解效率。图1(b)是菲降解过程中1-羟基-2-萘甲酸浓度变化曲线。根据已有文献报道，1-羟基-2-萘甲酸为PAHs代谢过程中一种典型的中间代谢产物[25]。菌株RS2接种初期并没有检测到1-羟基-2-萘甲酸。随着代谢过程的推进，1-羟基-2-萘甲酸开始被检出且其含量具有先增后减的趋势，意味着该产物会在降解过程中积累但可以被进一步代谢，可能是菲代谢过程中的限速步骤。(a) (b)图1 菲降解曲线及菌株生长曲线2.2菌株RS2对PAHS降解广谱性一些细菌以利用包括PAHs在内的烃类物质当唯一碳源来维持自身生长[26]因此单一的PAHs均能作为唯一碳源和能源促进菌株RS2生长，但对不同PAHs的降解效果差异很大，如表1所示，在供试条件下对比发现菌株RS2可快速降解菲(50mg·L−1)，超过90%的菲会在24 h内被降解，在72 h内可降解超过99%。超过90%的萘(100 mg·L−1)或苊(100 mg·L−1)可以在2 d内被降解。菌株RS2对萘(100 mg·L−1)降解24 h后，其降解率可超过60%，2 d内超过90%的萘(100 mg·L−1)被降解。菌株RS2在24 h内对苊(100 mg·L−1)的降解率只有50%，但2 d内降解率可超过90%。细菌生物量随着萘(100 mg·L−1)、苊(100 mg·L−1)降解呈增长趋势，第一天增长速率较高于第二天。可能是因为第一天萘和苊为菌株RS2的生长提供充足的碳源，第二天提供的碳源相对较少。但是当蒽(50 mg·L-1)或芘(20 mg·L-1)被用作底物时，降解过程明显减慢。菌株RS2对蒽(50 mg·L-1)降解3 d和7 d后，其降解率分别为23%和48%。芘(20 mg·L-1)降解更为缓慢，7 d和14 d降解率分别为25%和43%。细菌的生物量均增长缓慢，可能是因为蒽和芘的降解缓慢，为菌株RS2生长提供的碳源相对较少，并且菌株长时间处于毒性环境，不利于其生长。然而，当苯并芘(10 mg·L−1)作为底物时，菌株RS2对苯并芘的降解7 d和14 d降解率分别为8%和12%。同时菌株RS2的生长因提供的碳源和能源不足几乎被完全抑制，细菌的生物量基本不增长，甚至由于长期处于毒性环境随着天数的增加细菌生物量开始减少。结果表明，菌株RS2对PAHs（萘、苊、蒽、菲、芘、苯并芘）都有一定的降解效果，可为菌株RS2生长提供唯一的碳源和能源，其中菲的降解效果最显著更有利于菌株RS2的生长。表1 菌株 RS2 对 PAHs 的降解效率PAHs初始浓度(mg·L−1)降解时间(d)多环芳烃降解(%)细菌的生物量(log CFU·mL−1)对照00ND6.77 ± 0.25萘100166.78 ± 3.657.16 ± 0.13298.52 ± 4.877.41 ± 0.18苊100150.02 ± 2.327.23 ± 0.29294.19 ± 1.727.57 ± 0.14蒽50323.44 ± 1.306.95 ± 0.12747.81 ± 3.957.09 ± 0.16菲50194.12 ± 0.347.58 ± 0.09399.96 ± 0.037.42 ± 0.22芘20725.49 ± 4.746.84 ± 0.171443.45 ± 3.577.06 ± 0.21苯并芘1077.79 ± 3.086.75 ± 0.131411.58 ± 5.696.67 ± 0.25注ND未检测；±标准偏差(n = 3)。2.3环境因子对菌株RS2生长和菲降解的影响2.3.1底物浓度对菲降解的影响图2是在不同环境底物浓度下，菌株RS2对菲的降解效果。由图可知菌株RS2可以降解较高浓度的菲。实验起初底物浓度分别为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L，经过120 h之后，菌株RS2对底物菲的降解率均超过98%，且菌株RS2对高浓度菲也有一定耐受能力。对比发现降解速率先增大再减少，可能是因为反应后期降解速率受到了底物浓度不充足的影响。图2 底物浓度对菲降解的影响2.3.2温度对菌株RS2生长和菲降解的影响图3是在不同环境温度下，菌株RS2对菲的降解效果以及对其自身生长的影响。由图可知，该菌株RS2生长最适温度为30°C，此温度时细菌生物量最高菌株RS2生长最好(7.93 log CFU·mL−1)，对菲的降解效率99.63%。当温度为15°C时，降解率为41.93%，细菌生物量为7.04 log CFU·mL−1，随温度升高菲的降解速率呈增长趋势，这可能是因为温度升高逐渐接近微生物生长的最佳温度，从而使酶活性的增加，降解速率加快，30°C时达到最高，降解效率开始逐渐降低，酶活性降低；当温度为42°C时，降解率为16.15%，细菌生物量只有5.98 log CFU·mL−1。实验表明，菌株RS2在低温或高温的环境中，其对菲的降解能力降低，并且高温的影响更显著，可能是因为菌株RS2在低温或高温的环境中酶活性受到了抑制，影响了菌株RS2的生长，同时可能因为酶活性受到影响，进而影响细胞的通透性，均可导致菌株RS2对菲的降解效率降低。图3 温度对菌株生长和菲降解的影响2.3.3 pH对菌株RS2生长和菲降解的影响图4是在不同环境pH下，菌株RS2对菲的降解效果以及对其自身生长的影响。由图可知，菌株RS2的适宜pH为7.0。当pH为7.0时，细菌生物量最高为7.96 log CFU·mL−1，最适合菌株RS2生长，此时菲的降解效率为98.75%。当pH为4.0时，菌株RS2生长虽受到抑制，但降解率仍然为73.82%，细菌生物量为7.66 log CFU·mL−1，随着pH的升高菲降解效率呈增大趋势，在pH为7.0时达到最大，随着pH继续增大，降解效率呈减小趋势，当pH为10.0时，降解率为25.73 %，细菌生物量只有6.23 log CFU·mL−1，对比发现菌株RS2对酸性环境具有一定的耐受性，只有pH为10.0的强碱性环境才完全抑制了菌株的生长。实验表明，菌株RS2在过酸性或过碱性的环境中，其对菲的降解能力降低，可能是因为酶活性降低，并且菌株RS2在过酸性或过碱性的环境中生长受到了抑制，进而影响了菌株RS2对菲的降解效率。图4 pH对菌株生长和菲降解的影响2.4菌株RS2的成膜能力检测据研究，根际细菌在根际有明显的附着性能[27]，而菌株的附着性通常用细菌的成膜能力来反映。图5是菌株在离心管中成膜能力检测。实验发现，在PMM培养基中菌株RS2成膜能力在0-96 h期间持稳定增长趋势，96 h的时候达到最高为0.339，但在96-120 h期间，成膜能力出现减弱趋势，120 h时成膜能力检测值为0.321。这可能是因为随着时间的增长，生物膜生长成熟，随着生物膜内细胞的死亡、生物转化以及生物降解的作用最终导致了生物膜的脱落，即成膜能力的减弱。因此生物膜的形成是一个循环重复的过程，即生物膜脱落之后，其中的细菌从附着态转变成浮游生长状态，再次黏附到新的表面形成生物膜[28]。 图5 菌株成膜能力检测3.结论与展望基于本实验，菌株RS2均能以萘、苊、蒽、菲等为唯一碳源和能源生长，并经对比菌株RS2对菲的降解效果最好，72 h内可降解超过99%的菲。同时优化菲的降解条件能够促进菌株RS2生长及其对菲的降解效率，经实验得出，菌株RS2的最适温度为30°C时，对菲的降解效果高达99.63%；菌株RS2的适宜pH值为7.0，此时菌株RS2对菲的降解率均达到98.75%以上，并要保证实验过程中底物浓度充足。通过30°C恒温培养箱中静置培养，菌株RS2能在微型离心管中形成细菌生物膜，为之后的实验奠定基础。本研究用PAHs为目标污染物，把可高效降解菲的成膜细菌RS2从污染植物根表细菌生物膜中分离、筛选出来并明确其分类和成膜能力，研究其生长特性和对菲的降解特性，了解环境因子对菌株RS2降解菲的影响。在此基础上，综合地分析利用根表功能细菌生物膜降解PAHs的可行性，为根表功能细菌减低作物PAHs污染风险提供菌种资源和理论依据。致谢参考文献[1]宋玉芳，常士俊，李利，马学军，孙铁衍. 污灌土壤中多环芳烃的积累与动态变化研究[J].应生态学报, 1997, 8, 93-98.[2]许超，夏北成.土壤多环芳烃污染根际修复研究进展[J].生态环境,2007,16,216-222.[3]Gao Y, Zhang Y, Liu J, et al. 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目录
摘要.1
关键词.1
Abstract..1
Key words...1
引言.2
1材料与方法..3
1.1材料...3
1.1.1化学试剂 ..3
1.1.2培养基 ..3
1.1.3供试细菌 ..3
1.2方法...3
1.2.1菌株RS2对菲的降解3
1.2.2菌株RS2对PAHs的降解广谱性.3
1.2.3环境因子对菌株RS2生长和菲降解的影响4
1.2.4菌株RS2的成膜能力检测4
2结果与讨论..4
2.1菌株RS2对菲的降解动力学分析4
2.2菌株RS2对PAHs降解广谱性5
2.3环境因子对菌株RS2生长和菲降解的影响6
2.3.1底物浓度对菲降解的影响6
2.3.2温度对菌株RS2生长和菲降解的影响6
2.3.3 pH对菌株RS2生长和菲降解的影响..7
2.4菌株RS2的成膜能力检测8
3结论与展望..8
致谢.9
参考文献.9
附录...11
图 1 菲降解曲线及菌株生长曲线...5
图 2 底物浓度对菲降解的影响...6
图 3 温度对菌株生长和菲降解的影响...7
图 4 pH对菌株生长和菲降解的影响...8
图 5 菌株成膜能力检测...8
图 6 菌株RS2的透射电镜图.....11
图 7 菌株RS2的菌落形态.....11
表 1 菌株RS2对PAHs的降解效率...6
根表功能细菌RS2对PAHs的降解特性和成膜能力
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563350.html
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