从多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）污染场地中长势优势的健康植物看麦娘根际分离筛选出一株具有菲降解能力的根际促生细菌Phe2，结合菌株的菌落形态特征和16S rRNA基因序列同源性分析，初步确定菌株Phe2为类芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus sp.）。进一步研究了菌株Phe2对菲的降解能力、代谢途径以及对其它PAHs的降解能力，并分析了菌株Phe2的促植物生长特性。结果表明，菌株Phe2 能以菲为唯一碳源生长，并对菲有着良好的降解性能。在菲初始浓度为50 mg·L-1 时，30℃下 150 r·min-1 振荡培养6 d，菌株Phe2对菲的降解率可达 83.63%。初步确定菌株Phe2降解菲的途径为邻苯二甲酸途径。除菲外，菌株Phe2还可高效降解蒽，对芘和苯并[a]芘也有一定的降解能力。此外，菌株Phe2还可以产生吲哚乙酸和铁载体，且能够溶解有机磷和无机磷，具有多种促植物长特性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 实验试剂与材料 3
1.2 培养基 3
1.3 实验方法 3
1.3.1 菲降解功能菌株的分离筛选 3
1.3.2 菲降解菌株的鉴定 3
1.3.3 降解菌株菌悬液的制备 4
1.3.4 菌株Phe2对PAHs降解谱的测定 4
1.3.5 菌株对抗生素的抗性试验 4
1.3.6 菌株促生特性测定 5
1.3.7 菌株Phe2降解菲的中间产物提取与检测 5
2 结果与分析 6
2.1 菲降解功能菌株的分离筛选 6
2.2 菲降解菌株的鉴定 6
2.3 菌株Phe2对PAHs降解谱的测定 8
2.4 菌株对抗生素的抗性试验 9
2.5 菌株促生特性测定 9
2.5.1 菌株Phe2产吲哚乙酸（IAA）能力测定 9
2.5.2 菌株Phe2产铁载 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
体（Siderophore）能力测定 10
2.5.3 菌株Phe2溶磷能力测定 10
2.6 菌株Phe2对菲的降解中间产物的HPLCMS检测 11
3 讨论 13
4 结论 13
致谢 14
参考文献 14
一株具有菲降解能力的根际促生细菌的分离筛选及特性
引言
引言
土壤是地球表层系统中自然地理环境的重要组成部分，是人们赖以生活和生产发展的基础。多环芳烃（PAHs）是存在于土壤环境中常见的一种持久性有机污染物，其中菲是三环PAHs的代表。据2014年全国土壤污染状况调查公报表明，我国土壤环境中多环芳烃（PAHs）的点位超标率为1.4%。植物能够吸收、积累土壤中的多环芳烃（PAHs）并通过食物链向上级传递，最终将严重威胁到动物与人类的健康[1,2]。因此，解决PAHs污染区作物生产安全问题迫在眉睫。
利用细菌降解PAHs污染是目前控制环境PAHs污染的一种重要途径，不同种类的细菌降解PAHs的途径可能不同，但最有利的结果是细菌能将PAHs降解为无机小分子物质如二氧化碳和水，从而实现PAHs的去毒和消除目的[3]。事实上，PAHs在被细菌降解的过程中通常都会产生多种中间产物，而这些中间产物可能具有较强的毒性和生物难降解性[4]，仍然会对生态环境造成潜在的危害。因此，探究细菌的PAHs降解途径以及分析相应的中间产物显得尤为重要。
细菌代谢降解PAHs大多是在其分泌的各种酶的催化作用下进行的。在氧气的参与的条件下，细菌产生双加氧酶，氧分子在细菌双加氧酶的作用下加到PAHs的苯环结构上，然后PAHs被氧化成芳烃过氧化物，在芳烃过氧化物上加氢得到顺二醇，这两种过程产生的二羟基化合物—顺、反二醇都会代谢生成重要的中间产物，即苯酚类物质，接着经过脱水等作用而使碳碳键断裂、苯环开环，然后再经过三羧酸循环，形成中间产物酸或醛，如乙酸、丙酮酸或乙醛等，这些物质最终被细菌代谢分解为H2O和CO2[5]。具体来说，以细菌降解菲为例，当细菌受到菲的刺激后，会产生相关的氧化酶，菲的苯环结构经酶的催化相继被氧化，形成3,4二羟基菲和2羟基2H苯并［h］吡喃2羧酸脂等中间产物，然后在脱氢酶的作用下转化成1羟基2萘甲酸，之后菲的代谢分为两种途径，分别是邻苯二甲酸和水杨酸代谢途径[6]。通过邻苯二甲酸途径代谢菲的细菌有芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、气单胞菌属（Aeromonas sp.）、产碱杆菌属（Alcaligens sp.）等[7]，这些细菌会产生相应的双加氧酶、降解酶、脱氢酶等，在这一系列降解酶的作用下，1羟基2萘酸逐渐开环生成邻苯二甲酸和原儿茶酸，再经过三羧酸循环，这些中间产物最终被矿化为二氧化碳和水。通过水杨酸途径代谢降解菲的细菌有假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、分支杆菌属（Mycobacterium sp.）鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）等）。此类细菌产生1羟基2萘酸降解酶、水杨酸羟化酶、羟基粘康酸半醛水解酶等，在这些酶的作用下，1羟基2萘酸的苯环结构断裂生成水杨酸，之后产生邻苯二酚，在裂解酶的作用下邻苯二酚变成粘康酸半醛或粘康酸，这些中间产物经过三羧酸循环可进一步降解生成小分子量的有机酸，最终被细菌利用代谢为二氧化碳和水。
使用植物微生物联合技术来修复土壤中的PAHs污染是目前修复污染土壤的生物研究新领域[8]。此项技术可以结合植物修复与微生物修复的优点，促进污染土壤中根际有机污染物的降解。植物可以直接吸收和代谢土壤中的PAHs [9,10]，其细胞组织脱落物和根系分泌物为植物根际微生物提供了丰富的养分和能量，促进根际特定微生物功能群落数量的增加以及共代谢作用来达到降解PAHs的目的[11,12]。除此之外，微生物可以通过降解或改变PAHs生物可利用性的方法，减弱PAHs对植物的毒害作用，提高植物对PAHs的耐受性[13]，促进植物对污染物的吸收和转化。这种相互促进的作用对PAHs污染物的降解具有重要意义。
在土壤环境中，植物吸收有机污染物的主要途径是通过根系吸收，植物根表是有机污染物被根系吸收的重要界面[1416]。植物根际微生物中有许多细菌都是通过形成根表细菌生物膜的形式稳定存在于根际环境中，植物根系在吸收有机污染物的过程中，多需通过根表细菌生物膜。细菌生物膜可以分泌植物激素，增加作物产量，促进植物对矿物质的吸收[17]，增强植物对根际有机污染物毒性效应的抵抗能力等作用[18]。根际促生菌是一种定殖在植物根际系统中，并且具有可以促进植物生长能力的细菌，其能够通过产生以下1氨基环丙烷1羧酸脱氨酶 、3吲哚乙酸等物质的途径，来帮助植物耐受多种非生物胁迫，包括污染物、干旱、盐分、肥力低下等[19,20]。因此，运用具备菲降解能力的根际或根表促生功能菌株联合植物修复土壤中的PAHs 污染有很大的应用前景。

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