番茄叶枯萎病（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）病毒是美国南部地区广泛传播的一类植物性病毒。感染了TSWV的花生，植株矮化同时，植株的叶片上还会出现黄化坏死的环状斑点，进而严重影响花生的品质，并造成花生大规模的减产。本实验的研究目的在于利用花生已经公布的A和B全基因组测序的数据，根据已知的DNA序列在花生不同的染色体上设计简单序列重复分子标记（Simple Sequence Repeat, SSR），选用抗性亲本FL-113和易病亲本Georgia Valencia所构建的群体提取的DNA样本， 进行PCR扩增，之后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）的结果观察是否扩增的DNA条带与表现型出现共分离，以此来初步定位抗番茄枯萎病的基因的大致位置。实验发现花生A01染色体上很有可能存在抗TSWV的主效数量性状基因座(Quantitative Trait Locus，QTL)。本实验对于植物抗病机理的研究，和培育新的抗病品种都具有较为重要的意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.2 感抗情况的评级方法2
1.3基因型测定2
1.4 连锁分析以及连锁图的绘制3
2 结果与分析3
2.1 F2:3分离群体中感病情况3
2.2 SSR分子标记的测定 4
2.3 多态性分子标记的测定4
2.4 遗传连锁图的构建以及QTL分析6
3 讨论8
3.1 潜在的与抗TSWV相关的QTL8
3.2 分子标记协助育种9
4 结论9
致谢9
参考文献10
图1 PSREU中F2:3代的TSWV侵染情况以及亲本感染情况 3
图2 NFREC中F2:3代的TSWV侵染情况 4
图3 标记与表现型呈现共分离的带型图5
图4 A01染色体的物理图谱以及遗传图谱 6 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 

图5 A01遗传连锁图 7
图6 SSR标记构建的连锁图以及对应的LOD值 8
表1 SSR标记在花生全基因组中的分布 5
栽培花生抗番茄叶枯萎病（TSWV）的QTL定位
引言
花生是全世界最为重要的油料作物之一，属于豆科类的一年生草本植物，通常种植在热带，亚热带或者其它较为温暖和降雨量适中的地区。花生起源于南美洲[1]，野生的花生是二倍体（2n=2x=20）,而栽培花生是四倍体（2n=4x=40），根据基因组测序分析，用于栽培的四倍体花生品种很有可能是有两个野生的二倍体品种杂交，然后通过自然的染色体加倍而产生的属于异源四倍体，基因组型为AABB[2]。番茄枯萎病（TSWV），又名叶斑病，是由番茄枯萎病反转录病毒所引起的，TSWV病毒是通过一类特殊的蓟马来完成从一株植物到另一株植物之间的传播，但是仅仅当蓟马取食过受TSWV感染的植株后并携带有病原体，才能完成病毒的传播[4]。虽然TSWV并不是通过种子传播，但是受感染的植株的种子会产生明显的变色[5]。自1985年起，成为在美国南部地区广泛流行的一种病害，不仅危害花生，还会影响其他的作物[3]。花生在感染了TSWV病毒以后，会产生明显的植株矮化。除此之外，花生的叶片上也会产生同心圆状的黄化或坏死斑点。因此，番茄枯萎病很大程度地影响花生的质量。
植物患病的病原体无处不在，拥有一套完善的病害抵抗系统是非常重要的。植物并不像动物一样拥有循环系统，但是植物仍然可以在病原体入侵以后传递信号到整株植物的其它部位。相对于感病来讲，植物拥有两类机制：抗病性和耐病性。耐病性是植物在受到病原体侵染后，能够补偿部分由于病菌侵染而带来的负面效应，但是却并不限制病菌的繁殖或者试图消灭病菌。抗病性是指植物有能力去抵御病原体造成的病理性侵染。
分子标记作为分子辅助选择的最基本的工具，从上个世纪开始兴起。 分子辅助选择主要是利用分子标记来根据基因型来选择所需要的亲本和株系。但是，关于栽培花生的分子标记发展速度却比较缓慢，主要原因是由于花生复杂的四倍体基因组，早期的一些分子标记例如限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLPs），随机扩增多态性和扩增片段长度多态性在花生的基因组中多态性水平都较低。随着第二代测序技术的兴起，对于花生基因组内分子标记的研究取得了飞跃性的进展，大量的简单序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）标记被发现并用于基因定位。
考虑到番茄叶枯萎病对于美国南部地区花生造成的严重影响以及目前尚不明确的遗传机制，本试验旨在利用分子标记定位技术，确定抗性基因的位置，不论对于植物抗病机理的研究，还是培育新的抗病品种，都具有较为重要的意义。
1 材料与方法
1．1 试验材料
栽培花生品种FL113，是一种新型的runner类型的花生，对于叶枯萎病具有很高的抗性，由佛罗里达大学花生育种项目组于2012年培育出来。Georgia Valencia是由佐治亚大学于2000年培育出来，是具有大荚果的Valencia类型品种，但是对叶枯萎病非常敏感。亲本种植于Marianna 的North Florida research and education center (NFREC)以及位于Citra的Plant Science Research and Education Unit (PSREU)，2009年杂交形成F1，F1自交产生200株F2分离群体，。分离群体于2013年种植于NFREC，所有的F2代自交产生F2:3群体，与2014年分别种植于PSREU和NFREC。
1．2 感抗病情况的评级方法
本实验完全采用自然接种的方法，利用NFREC以及PSREU试验田中天然存在的蓟马作为TSWV的传播载体，完成对植株的侵染；统计小区内的感病程度，采用大田实地目测的方法，根据严重程度由轻到重采用1到10分级。目测法是以整个小区为单位进行评估，每个小区的得分根据叶斑病的典型症状例如矮化，同心圆状叶片黄化等特征判断。1到10代表着病株在整个小区所占的百分比。在本实验中，1=0%，1.5=小区内少于10%的病株，2=11%20%的病株，3=21%30%的病株，4=31%40%的病株，5=41%50%的病株，6=51%60%的病株，7=61%70%的病株，8=71%80%的病株，9=81%90%的病株，10=91%100%的病株。记录下植株的感病程度，作为表现型数据。

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