本论文基于杂交链式反应（HCR），结合双极电极（BPE）和电致化学发光（ECL）构建了DNA生物传感器。双极电极-电致化学发光技术具有快速简单、灵敏度高、选择性好、可控性、可视化、易于微型化等优点，因此在生物科学领域受到广泛的关注。该传感器结合杂交链式反应、电沉积金纳米颗粒等信号放大策略，进一步提高了该传感器的灵敏度。首先，我们在ITO玻璃表面沉积金纳米颗粒，不仅增大了电极的面积，而且提高了电子传递效率，实现ECL信号放大，然后将目标DNA组装在电极上，随后通过杂交链式反应，使ECL信号的降低变化值增大，进一步有效地放大信号。该传感器可高灵敏地检测目标DNA，且线性范围为1×10-10 M 到 1×10-6 M。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 4
1.1 仪器及试剂 4
1.1.1 实验仪器 4
1.1.2 实验药品 4
1.2 溶液的配制 5
1.2.1 10 mM HAuCl4的配制 5
1.2.2 2 mM Ru(bpy)32+（含20 mM DBAE） 5
1.2.3 1 mM双氧水溶液的配制 5
1.2.4 DNA的配制 5
1.2.5 1 μM mercaptohexanol（MCH）的配制 5
1.2.6 10 mM的TCEP溶液的配制 5
1.3 实验方法 5
1.3.1 ITO双极电极的制备 5
1.3.2 ITO/镀金 5
1.3.4 ITO表面构建生物传感界面 5
1.3.5 发光检测 6
2 结果与分析 6
2.1 镀金对发光的影响 6
2.1.1空白ITO与镀金ITO拍照实验 6
2.1.2空白ITO与镀金ITO的ECL对照实验 6
2.2 可行性分析 7
2.2.1 双氧水对发光的影响 7
2.2.2 层层组装的ECL信号检测 8
2.3 发光液浓度的优化 9
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
2.4 标准曲线 10
3 结论 10
致谢 11
参考文献 11
基于杂交链反应的电致发光生物传感器构建
引言
电致化学发光（ECL）[1,2]是指在电极表面上，发光物质发生电化学和化学反应，进而生成激发态，再返回基态时而产生光的过程。ECL能够同时检测两个参数（发光强度和法拉第电流）与外加电压之间的关系[1]。因此，可通过改变电压来控制电化学反应，提高分析检测的灵敏度。此外，因为不采用激发光源，所以不会产生背景信号，而且也不需要额外连接设备来扣除激发装置的杂散光。因此ECL具有信号背景低、灵敏度高、可控性强等优点。ECL反应中最典型为三丙基胺（TPA）钌联吡啶（Ru(bpy)32+）的反应体系，Ru(bpy)32+作为发光物质，TPA作为共反应物，其反应机理如图1所示。首先，在电极表面Ru(bpy)32+失去一个电子被氧化成Ru(bpy)33+，与此同时三丙胺（TPA）也失去一个电子被氧化成TPA+，然后再失去一个H+生成TPA。接着，Ru(bpy)33+与TPA发生氧化还原反应，生成激发态Ru(bpy)32+*，随后激发态Ru(bpy)32+*变回基态Ru(bpy)32+，同时产生强烈的橙色发射光，其波长为610 nm，实现ECL的可视化。


图1 三丙胺钌联吡啶体系电致化学发光原理示意图[2]
DNA生物传感器与电致化学发光技术结合，可实现生物分子的可视化检测。DNA生物传感器与各种检测手段的联用拓宽了其应用范围，而且结合信号放大策略显著提高了其检测灵敏度。传统的电致化学发光技术以三电极系统为基础。而双极电极是直接被置于阴阳两极间的电解质溶液中的导体，而且无需与外部电源连接。当在双极电极两端施加的电压（Etot）足够大时，导体两端会产生电势差（△Eelec），使电极的一端发生氧化反应，另一端发生还原反应，从而分别极化成为阴阳两极[3]。由于双极电极结构简单、加工方便、材料易于获得以及其尺寸较小、且无需有线连接，极大地扩宽了电化学的应用范围。Laurent Bouffier课题组提出了间接双极电极（indirect BPE）的概念，并构建了一种新的传感方法：电活性分子在双极电极附近产生荧光，会产生局部pH梯度变化，即检测pH就可以对氧化还原活性分子进行间接检测[4]。
双极电极分为开放式和闭合式两种类型[5]。在开放式体系（图2A）中，电极与溶液为并联（图2B），因此其电流效率低，而且在实际的信号放大技术上的设计受到了很大的限制。而闭合式双极电极（图2C）可以将阴阳两极分隔为两个独立的区域，从而避免两端相互干扰，而且闭合式的电流效率高，因为其电极与溶液为串联（图2D），串联电路的总电阻大于任何一个分电阻，在相同的外加电压下，闭合式体系的电流比开放式体系的小，使施加在溶液与双极电极界面上的电压比开放式体系的大，即只需较小的电流通过电极，就可达到能够发生氧化还原反应的电压[6]。


图2 双极电极示意图A.开放式双极电极装置图;B.开放式双极电极等效电路图;C.闭合式双极电极装置图;D.闭合式双极电极等效电路图。ichannel:流经微管道的电流;is:电解质溶液中离子迁移产生的电流;iBPE:流经双极电极的电流
因为电流在双极电极上不能被直接检测，因此将ECL与BPE结合，即双极电极电致化学发光技术。Zhang课题组对于双极系统提出了一种更加通用和精确的机制，他们先在ITO上电沉积Pt，以此来增强信号的的稳定性，构建多功能的ECL传感器，这个装置可以检测双氧水、抗坏血酸、TPA、葡萄糖、血糖，而且该装置的阵列可以作为高通量的分子键盘锁（molecular keypad lock），应用于可视化ECL实验中[7]。BPEECL系统通常由电极与嵌入的微管道组成[8]，双极电极的微管道电阻很大，如图3所示，ΔEelec的大小取决于双极电极的长度（lelec）和电场强度（Etot/lchannel）成比例[9]，如式（1）所示。因为双极电极是电中性的，所以氧化反应和还原反应会同时发生在双极电极的两端[10]，而且两端发生的反应速率是一致的，因此阴极反应与ECL信号强度有着直接的关系[3]。另外，以ITO玻璃作为阳极，因为它具有高透明度，适用于ECL信号检测[8]。

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