我国土壤污染状况严峻，尤其是以多环芳烃（PAHs）为代表的有机物污染。PAHs是土壤环境中常见的有机污染物，具有强致癌性、致畸性和致突变性（三致效应），其疏水性强、难降解、易在土壤中积累并被植物吸收，对人类的健康造成了巨大的威胁。为了系统的研究植物吸收积累PAHs的能力以及功能菌在植物根表的定殖能力，本文选择菲为目标污染物、紫花苜宿为供试植物、PAHs功能降解菌RS2为供试菌株。通过对紫花苜蓿加以灌根处理，利用激光共聚焦显微镜检测目标菌株在植物根表的定殖成膜情况并同时测定植株和土样中菲的含量以及紫花苜宿的生物量，探究菲在植物体内的富集与传导效率，以反映灌根方式下菌株RS2在紫花苜蓿根表的定殖效率以及对植物吸收积累菲的影响，以期在防治植物PAHs污染中发挥作用。
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摘要 3
引言
引言
我国是一个农业大国，需特别重视土壤质量和农作物质量，但我国的土壤质量却不容乐观。重金属污染、有机物污染、农药污染、放射性污染等深深地影响着我国土壤的质量，其中多环芳烃（PAHs）是一种常见的、能持久存在于土壤中的、有“三致效应”[]的有机污染物。污染土壤中含有大量PAHs，这些PAHs通过多种途径进入土壤[2]，植物吸收之后叶子可变萎黄，花期延迟，甚至病变坏死[3]。植物对PAHs可通过植物根系被植物吸收并进入植物体内，随着植物的蒸腾作用向上传输[4]，并沿食物链被人体吸收[5]，从而威胁人体健康。因此，土壤和植物PAHs污染也越来越受到重视，在受PAHs污染的土壤中种植出安全的农作物也成为研究重点[6]。而利用具有PAHs降解功能的菌根真菌、植物内生细菌或是根际和根表细菌，皆可有效减低植物对根际土壤中PAHs的吸收积累，进而减低植物PAHs污染风险。
大多数植物的根系细菌都可在根表形成稳定的生物膜[7]，在根表形成生物膜是根际细菌的一种常见的生存方式，这使得植物根表普遍存在成膜的现象。形成的生物膜能有效的阻挡PAHs进入到植物根系从而减少植物中PAHs的含量，从而提高农作物的质量。在根表面的活性细菌生物膜扩大了植物根与土壤之间的界面，可有效促进根际有机污染物的代谢[8]，这一现象充分地的说明了利用植物根表功能微生物减低植PAHs污染是可行的。此外，生物膜还具有很多其它的生态功能，如促进植株的生长、减 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
轻病原体对植物的的干扰、增强植物对恶劣生长环境下的适应性、促进植物根系吸收利用土壤中的养分等多种功能[9]。
本实验将通过灌根方式使菌株RS2定殖到紫花苜蓿的根表并形成生物膜，观察在这种方式下菌株的定殖分布情况，再通过对植株的各个部分以及土壤中的菲含量的测定，来确定这种植物微生物联合的方法对植物吸收积累PAHs的影响，从而为经济高效且科学的解决土壤中的有机污染物、保障农作物质量提供依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验试剂：菲购于Fluka公司（NeuUlm，德国），其纯度≥98％。所用的化学试剂中，除了甲醇为高效液相色谱纯（Highperformance liquid chromatography, HPLC），其余的均为分析纯。
供试植物：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）。
供试PAH降解功能菌株：菌株RS2，菌株RS2gfp。由土壤污染控制与修复研究所提供。
LB培养基（gL1）：NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，pH 7.0。加入18 gL1琼脂，LB培养基变成PMM固体培养基。
土样：南京江宁区旱作水稻土表层（0至20 cm），土壤为pH值7.08，有机质含量19.9 gkg1的黄棕壤。土样采集经风干后过2 mm筛得实验备用土。
1．2 实验方法
1．2．1 菌株RS2简介
菌株RS2是从菲污染土壤中的植物根表分离纯化得到的。菌株RS2可以以菲为唯一碳源进行生长代谢，对菲有很好的降解效果，对浓度为100 mgL1的菲在72h内其降解率就高达98%。
菌株RS2在根际处有明显的附着能力，成膜能力很强，且随着时间的延长而增强。
1．2．2 菌株RS2的GFP基因标记
菌株RS2进行荧光标记是采用改进的三亲接合方式。三亲接合所用的菌落为RS2，质粒的基因型和表型以及来源如表1所示。具体操作步骤为：将菌株 RS1（链霉素 50 mgL1）、pBBRGFP45（卡那霉素 50 mgL1），pRK2013（卡那霉素 25 mgL1），分别在含有各自抗性的LB液体培养基中，培养温度为30°C，培养18 h后各取 1 mL培养液，分别置于1.5 mL灭菌的离心管中，离心。用无菌水洗涤三次，各取100μL置于1.5 mL灭菌的离心管中，充分混合。在LB平板上放置灭过菌的0.22μm的微孔滤膜，用移液枪吸取100μL混合菌体滴在滤膜上，30°C条件下培养过夜，供体质粒和辅助质粒为空白对照。将滤膜上菌体用无菌水稀释后，置于PMM固体选择性平板，筛选结合子并培养至具有单菌落。单菌落扩大培养后，用荧光显微镜观察进行荧光验证，并纯化保藏[10]。最终所的的就是菌株RS2gfp。
据其他研究表明，菌株RS2和在成膜能力、降解能力以及生长速度等方面没有明显差异，所以可以用RS2gfp来代替RS2进行各方面的研究实验，使实验结果更易观察，结论更有信服力。
表 1三亲接合法所用菌株和质粒
菌株/质粒
基因型或表型
来源
RS2
菲降解菌株
本研究
pBBRGFP45
pBBRMCS2 vector with 1.4 kb foreign fragment (gfp)
虞方伯 2007
pRK2013
mob+,tra+,Kmr,辅助质粒
本实验室
1．2．3 温室盆栽试验

原文链接：http://www.jxszl.com/hxycl/hxyhj/563399.html