雌三醇降解菌的固定化研究
*景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072*
action of sodium alginate: 5%, bacteria and glue ratio: 1:2, CaCl2 H2O2 mass fraction: 4% Oscillating for 7 d with 150 r·min-1 on 30℃, the removal rate for estriol was 100% by the immobilized microbial inoculum. As the substrate concentration increaseing from 50 mg·l-1 to 250 mg·l-1, the removal rates decreased gradually from 100% to 90.74%. On the other hand, the removal rate increased from 98.68% to 100% with the inoculum increasing from 100 g·l-1to 300 g·l-1, and estriol could be removed totally by immobilized microbial agent on the inoculum 150 g·l-1.雌三醇作为雌激素的一种，在环境中不易降解，能够破坏生物机体的稳定，影响生物体正常的生长发育及行为[1,2,3]。现阶段在全球范围内雌激素对环境的污染非常严重，导致物种种类减少，珍稀物种濒临灭绝，人类疾病种类和发病率增加等严重的危害[4]。本实验采用固定化雌三醇降解菌的方法去除雌三醇。固定化的发展主要是由于在治理和研究一些污染体系时，污染物处于游离体系中，使用降解菌降解污染物时存在菌体自然沉降困难的问题，在实际操作中也会造成菌体流失和固液分离难等一些列问题，虽然使用离心机或化学凝聚剂使菌体沉降，但会产生额外的费用，为解决这一问题，微生物固定化技术迅速发展起来[5-6]。近年来，微生物固定化技术的研究受到了国内外学者的青睐，成为环境保护研究的热点而显示了其独特的优越性[7]。固定化方法多种多样，包括包埋法、吸附法、结合法、交联法以及后来出现的无载体固定法等[8]，本课题使用海藻酸钠包埋法固定化雌三醇降解菌技术去除雌三醇，通过实验测定固定化雌三醇降解菌的去除效果，不同接种量对去除效果的影响，雌三醇浓度对去除效果的影响。1 材料与方法1.1 实验材料供试菌菌株为Novosphingobium sp. ARI-1，购自ATCC，编号BAA-531。化学试剂有雌三醇（E3，纯度≥98%），海藻酸钠，CaCl2·2H2O，甲醇。R2A培养基(g·L-1)：胰蛋白胨0.25，酸水解酪蛋白0.5，酵母浸粉0.5，可溶性淀粉0.5，磷酸氢二钾0.3，硫酸镁0.1，丙酮酸钠0.3，蛋白胨0.25，葡萄糖0.5，pH 7.0~7.4。无机盐培养基(MSM)(g·L-1)：(NH4)2SO4 1.50，K2HPO4·3H2O 1.91，KH2PO4 0.50，NaCl 0.50，MgSO4·7H2O 0.20，微量元素溶液2 mL，pH 7.0。其中微量元素溶液成分(g·L-1)：CoCl2·6H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.425，ZnCl2 0.05，NiCl2·6H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.015，Na2MoO4·2H2O 0.01，Na2SeO4·2H2O 0.01。[9]1.2 实验方法本实验首先通过正交实验确定雌三醇降解菌的最佳固定化条件，使用包埋法进行固定化，然后通过摇瓶培养实验研究不同条件（雌三醇浓度和接种量）对固定化雌三醇降解菌去除雌三醇的影响。1.2.1 正交实验菌悬液制备：在R2A培养基上接种Novosphingobium sp. ARI-1，30℃、150 r·min-1振荡5 d，8000 r·min-1离心5 min，弃上清液，用MSM洗涤菌体，重复离心2次后，利用MSM重悬浮菌株，调整菌悬液浓度至D600=1.0。制备固定化菌剂：将菌悬液与海藻酸钠胶液以一定的菌胶比充分混匀，匀速滴入4℃的CaCl2溶液后，于4℃交联一定时间，得到直径为3~5 mm，质量为0.03~0.05 g的固定化颗粒。正交实验：设计四因素三水平的正交表（见图1-2-1），以雌三醇去除率为指标，确定最佳固定化条件。表1-2-1 正交试验各因子水平水平因素A因素B因素C因素D海藻酸钠浓度（%）菌液与海藻酸钠体积比CaCl2·2H2O浓度（%）固定化时间（h）141:124251:236362:1481.2.2 雌激素降解培养基 准备雌三醇溶液，制备雌激素降解培养基。雌激素降解培养基：1000 mg·L-1的雌激素甲醇溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待甲醇挥发完全后加入灭菌的无机盐培养液，使雌激素的最终浓度达到实验设计浓度。1.2.3 固定化雌三醇降解菌剂对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响使用50ml锥形瓶42个，加入浓度为50 mg·L-1的雌三醇溶液，风干后加入20 ml无机盐培养基，在其中21个锥形瓶中接入固定化雌三醇降解菌剂150 g·L-1，另外21个作为对照（ck）。每24 h取3个锥形瓶含固定化雌三醇降解菌剂150 g·L-1，及3个对照。通过高效液相色谱法[10]测定固定化雌三醇降解菌株ARI-1 以雌三醇（E3）为唯一碳源， 7 d内对50 mg·L-1 E3的去除率。1.2.4 不同污染强度对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响在雌三醇浓度分别为50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-1的无机盐培养基（20ml）中，接入150 g·L-1的固定化雌三醇降解菌，同时做对照试验，分别做三个平行样。摇床培养7 d后，使用高效液相色谱法测定培养基中E3的浓度，计算E3的去除率。1.2.5 不同接种量对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响 在浓度为50 mg·L-1的无机盐培养基（20ml）中，分别接入0 g·L-1、100 g·L-1、150 g·L-1、200 g·L-1、250 g·L-1、300 g·L-1的固定化雌三醇降解菌，每个梯度做三个平行。摇床培养7 d后，使用高效液相色谱法测定培养基中E3的浓度，计算E3的去除率。1.2.6 分析方法测定方法为整瓶提取。加入20 mL甲醇，超声30 min后，用HPLC法测定雌三醇浓度。高效液相色谱（岛津LC-20AT）参数为：色谱柱为Inertsil ODS-SP-C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈/水（体积比为70：30）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL，检测波长：280 nm。1.2.7 数据分析、 各实验结果计算公式如下：固定化雌三醇降解菌去除率计算：（对应天数对照组雌三醇浓度平均值表-对应天数各样品雌三醇残留浓度表）／对应天数对照组雌三醇浓度平均值固定化雌三醇降解菌对不同污染强度的去除率计算：（不同污染强度对照组雌三醇浓度平均值-对应不同污染强度各样品雌三醇残留浓度）／对应不同污染强度对照组雌三醇浓度平均值固定化雌三醇降解菌不同接种量去除率的计算：（不同降解菌接种量对照组雌三醇浓度平均值-对应不同接种量各样品雌三醇残留浓度）／相应不同降解菌接种量对照组雌三醇浓度平均值对计算结果进行分析，得出结论。2 实验数据与分析2.1 实验数据 记录实验各项数据，进行统计、计算。2.1.1 正交实验实验数据 K1、K2、K3为表1-2-1各水平所得相应因素的去除率，将同一水平同一因素的去除相加即得到该水平该因素去除率。表2-1-1 固定化菌剂去除E3的正交试验结果实验编号因素去除率(%)海藻酸钠浓度(%)菌悬液体积:海藻酸钠体积CaCl2·2H2O浓度(%)固定化时间（h）141:12494.82241:23698.04342:14896.77451:13897.37551:24498.10652:12698.27761:14698.11861:22896.81962:13497.05K1289.63290.30289.90289.97K2293.74292.95292.46294.43K3291.97292.09292.98290.962.1.2 固定化雌三醇降解菌剂对雌三醇的去除率通过高效液相色谱测定出峰值，用标准曲线求出各样品浓度。固定化雌三醇降解菌去除率计算：[对应天数对照组雌三醇浓度平均值（表2-1-2）-对应天数各样品雌三醇残留浓度（表2-1-3）]／对应天数对照组雌三醇浓度平均值（表2-1-2）去除率平均值计算=每天各样品去除率（表2-1-3）的和／样品数表2-1-2 固定化雌三醇降解菌对雌三醇去除的对照试验结果（CK）CK浓度浓度平均值标准偏差1号样品2号样品3号样品1 d28.4595639225.6393899424.5976544426.232202771.9980381632 d24.4611056126.8374958727.3869948226.22853211.5550995423 d24.1714899225.3211430526.6833278325.391986931.257416624 d27.0324083324.2518775524.802477725.362254521.4723621915 d25.0216165625.2826010423.5151745424.606464050.9540507396 d23.9479462624.6681312623.013027223.876368240.8298704277 d23.5570201522.639720323.3290716923.175270710.477599008表2-1-3 固定化雌三醇降解菌对雌三醇去除的试验结果(加入固定化降解菌)固定1号样品2号样品3号样品去除率平均值（%）标准偏差1 d浓度0.9846162320.85687699696.489720.09032528去除率96.24622196.733217112 d浓度0.5441361080.4967844950.44612928198.110242870.186857387去除率97.9255199898.1060446298.299164013 d浓度0.2666336310.2666336310.26773483198.948402140.00250405去除率98.9498478598.9498478598.945510714 d浓度0.1961568110.2082700140.19835921299.207694480.025443395去除率99.22651199.17874699.217826455 d浓度0.1047571850.1036559850.10255478599.540441130.004528316去除率99.5359128299.5404411399.544969456 d浓度0.0397863670.0265719630.02877436499.867207290.0296471去除率99.8333904299.8887271299.879504347 d浓度-0.007565246-0.105572074-0.105572074100.31450880.244108146去除率100.032637100.4554447100.45544472.1.3 不同污染强度对固定化雌三醇降解菌去除雌三醇的影响 通过高效液相色谱测出各样品的峰值，用标准曲线求出各样品的浓度。固定化雌三醇降解菌对不同污染强度的去除率计算：[不同污染强度对照组雌三醇浓度平均值（表2-1-4）-对应不同污染强度各样品雌三醇残留浓度（表2-1-5）]／对应不同污染强度对照组雌三醇浓度平均值（表2-1-4）降解率平均值计算=不同污染强度各样品去除率（表2-1-5）的和／样品数表2-1-4 不同污染强度降解率的对照试验结果（CK）CK浓度浓度平均值（mg·L-1）标准偏差1号样品2号样品3号样品50 mg·L-123.5570201522.639720323.3290716923.175270710.477599008100 mg·L-150.6619645452.4481114451.6321220151.580732670.894181657150 mg·L-173.9897918778.0796498276.0137980476.027746582.044964651200 mg·L-198.9870388795.7054619590.7467569795.146419264.148488643250 mg·L-1125.826594116.0622509122.3159674121.40160414.945972546表2-1-5 不同污染强度去除率的试验结果（加入固定化降解菌）固定1号样品2号样品3号样品去除率平均值（%）标准偏差50 mg·L-1浓度-0.105572074-0.007565246-0.105572074100.31450880.244108146去除率100.4554447100.032637100.4554447100 mg·L-1浓度0.048595970.0739235770.09154278299.669350740.100038901去除率99.7748101599.6574440499.57579805150 mg·L-1浓度1.406375951.263219911.14098667598.329131570.174732999去除率98.1499921798.3383058398.49909672200 mg·L-1浓度5.0425393689.6433542565.02271776293.094873732.798005222去除率94.6998745389.8640379994.72070868250 mg·L-1浓度10.9714018311.4713467711.2874463290.738551640.208291911去除率90.9626014690.550785290.702268272.1.4 不同接种量对固定化雌三醇降解菌去除雌三醇的影响 通过高效液相色谱测出各样品的峰值，用标准曲线求出各样品的浓度。固定化雌三醇降解菌不同接种量去除率的计算：[不同降解菌接种量对照组雌三醇浓度平均值（表2-1-6）-对应不同接种量各样品雌三醇残留浓度（表2-1-6）]／相应不同降解菌接种量对照组雌三醇浓度平均值（表2-1-6）去除率平均值计算=不同接种量各样品去除率（表2-1-6）的和／样品数表2-1-6 固定化雌三醇降解菌不同接种量降解率的试验结果1号样品2号样品3号样品浓度平均值（mg·L-1）CK23.5570201522.639720323.3290716923.17527071固定降解率平均值（%）标准偏差100 g·L-1浓度0.2479132250.2435084240.42630767598.68028570.449917592去除率98.9304865298.9494891198.16088147150 g·L-1浓度-0.007565246-0.105572074-0.105572074100.31450880.244108146去除率100.032637100.4554447100.4554447200 g·L-1浓度-0.105572074-0.105572074100.45544470去除率100.4554447100.4554447250 g·L-1浓度-0.105572074-0.105572074-0.105572074100.45544470去除率100.4554447100.4554447100.4554447300 g·L-1浓度-0.105572074-0.105572074-0.105572074100.45544470去除率100.4554447100.4554447100.45544472.2 数据分析 从正交实验试验结果（表2-1-1），因素A、B、D的水平2，因素C的水平3得到的去除率最高，故确定菌株ARI-1的最佳固定化条件：海藻酸钠为5%，菌悬液与海藻酸钠之比为1:2，CaCl2·2H2O浓度为4%，交联时间为6 h。实验所用固定化雌三醇降解菌均根据菌株ARI-1的最佳固定化条件制备。 对固定化雌三醇降解菌对雌三醇的去除率试验结果（表2-1-3）进行分析，得到图2-2-1。由图2-2-1得到固定化菌株7 d对50 mg·L-1的雌三醇（E3）去除率为100%。图2-2-1 固定化雌三醇降解菌对雌三醇的去除率对不同污染强度对固定化菌株ARI-1去除E3的试验结果（表2-1-5）进行分析，得到图2-2-2。由图2-2-2可知，当E3浓度较低时，固定化降解菌对E3的去除率较高，E3浓度为50 mg·L-1时降解率达到100%，而E3浓度为250 mg·L-1时降解率只有90.7%，因此随着E3浓度的升高，固定化降解菌对E3的降解率逐渐下降，表明高浓度的E3对菌株生长产生抑制作用而使得降解率下降。图2-2-2 不同污染强度（雌三醇浓度）对去除率的影响对固定化雌三醇降解菌不同接种量试验结果（表2-1-6）进行分析，得到图2-2-3。由图2-2-3可知，随着固定化降解菌接入量的增大，E3降解率也逐渐增大。当接入量达到150 g·L-1时，固定化降解菌对E3的降解率达100%。图2-2-3 不同接种量对雌三醇去除率的影响3 讨论 通过正交实验得到的最佳固定化条件为海藻酸钠为5%，菌悬液与海藻酸钠之比为1:2，CaCl2·2H2O浓度为4%，交联时间为6 h，这四个因素对雌三醇降解菌的固定化小球都有较大的影响，为测出最适的条件，每个因素设计了三个水平[11]。 海藻酸钠的三个水平为4%，5%，6%。由表2-1-1可以看出5%的去除效果最好，因为海藻酸钠在5%的时候成球形态最理想，最易降解雌三醇，而海藻酸钠浓度为4%时，成球不够坚硬，海藻酸钠浓度为6%时，成球过于坚硬，均不利于雌三醇的去除。 菌悬液与海藻酸钠体积比的三个水平为1:1，1:2，2:1。由表2-1-1可以看出体积比为1:2时去除雌三醇的效果最后，而使用2:1或1:1的体积比固定化小球中菌悬液浓度过低，去除效果均不理想。 CaCl2·2H2O浓度的三个水平为2%，3%，4%。由表2-1-1看出CaCl2·2H2O浓度为4%时去除率最高，固定化小球成球形态最理想，而2%，3%的浓度低，固定化小球的形成不完整，去除效果不理想。交联时间的三个水平为4h，6h，8h[12]。由表2-1-1看出交联时间为6h时降解效果最佳，过短和过长的交联时间均不利于固定化小球的形成。在测定固定化小球对E3的降解率时，培养至第七天，雌三醇被全部去除（表2-1-3），可以看出固定化雌三醇降解菌对雌三醇的间接效果十分良好，能够基本去除雌三醇污染[13-15]。在使用不同底物浓度测定150 g·L-1固定化雌三醇降解菌对其的降解效果，可以看出底物浓度为50 mg·L-1时降解率达到100%，在100 mg·L-1和150 mg·L-1时降解率接近100%，但没有达到，而浓度提升至200 mg·L-1时降解率明显下降，故浓度逐渐增高时降解率越来越低，因此固定化雌三醇降解菌适宜去除较低浓度的雌三醇污染物。不同的固定化雌三醇降解菌接种量也会影响去除率，针对雌三醇浓度为50 mg·L-1，去除率在150 g·L-1是就达到100%，故接种量越高降解越完全，但接种量越高，成本也越高。在保证去除效果的基础上，去除雌三醇的最佳接种量为150 g·L-1。4 小结实验得出最佳固定化条件是海藻酸钠为5%，菌悬液与海藻酸钠之比为1:2，CaCl2·2H2O浓度为4%，交联时间为6 h，按照这个条件制备的固定化小球具有较良好的降解性能。通过7天的培养，固定化小球的降解率可以达到100%，说明此菌种固定化后对雌三醇的降解率十分良好。同时通过实验可以得到对于浓度为50 mg·L-1的雌三醇，固定化降解菌的最佳接种量为150 g·L-1，而雌三醇浓度越高越不易被降解，在雌三醇浓度为50 mg·L-1到150 mg·L-1之间接种150 g·L-1的降解率均良好。致谢参考文献：[1]罗宇煊，张甲耀，龚利萍，管筱武.正交实验选择嗜碱细菌降解木质素的最优综合培养条件[J].环境科学，2001，22（5）：130[2]岳强.环境雌激素降解及检测研究[D].河北：河北大学，2006：1[3]李国学，孙英.高温堆肥对六六六（HCH）和滴滴涕（DDT）的降解作用研究[J].农业环境保护，2000，19（3）：141-144[4]严珍珍.环境雌激素类物质生物学检方法的建立及应用[D].浙江：浙江理工大学，2012：20[5]申婷婷,李小明等.微生物固定化技术的研究与应用[J].广州化工，2011，39（20）：79-83[6]Wang Jianlong.Biodegradation of quinoline by gel immobilized Burkholderiasp[J]. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1正交实验2
1.2.2雌激素降解培养基2
1.2.3固定化雌三醇降解菌剂对雌三醇的去除作用2
1.2.4不同污染强度对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响2
1.2.5不同接种量对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响2
1.2.6分析方法3
1.2.7数据分析3
2实验数据与分析3
2.1实验数据3
2.1.1正交实验实验数据3
2.1.2固定化雌三醇降解菌剂对雌三醇的去除率3
2.1.3不同污染强度对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响4
2.1.4不同接种量对固定化雌三醇降解菌剂去除雌三醇的影响5
2.2数据分析5
3讨论 6
4小结7
致谢7
参考文献7
雌三醇降解菌的固定化研究
引言
引言
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