纳豆激酶产生菌株的筛选及产酶条件初步优化
本文是围绕纳豆芽孢杆菌的筛选、酶活测定以及发酵条件优化展开的。首先从纳豆浸泡液中分离纳豆芽孢杆菌，经测定所得菌种为革兰氏阳性杆菌。其次，通过比较纤维蛋白平板法、脱脂奶粉平板法和试管定量法三种方法，发现脱脂奶粉平板法是一种易操作、经济实惠，并且能够快速、准确地测定纳豆激酶酶活检测方法。最后，通过发酵培养基的单因素优化实验和正交实验，确定最佳的发酵培养基为2%可溶性淀粉，1%蛋白胨，1%氯化钾，0.5%磷酸氢二钠和0.5%磷酸二氢钠，在发酵60h测得其酶活最高为200U/ml，比未优化前提高了2倍。
关键词 纳豆芽孢杆菌，纳豆激酶，酶活测定，发酵条件优化
1 引言 1
1.1 研究目的和意义 1
1.2 国内外研究现状 1
1.3 研究内容和方法 2
2 实验过程 2
2.1 材料 2
2.2 主要仪器设备 3
2.3 培养基和溶液 3
2.4 实验方法 4
2.5 生长曲线 6
2.6 纳豆激酶酶活测定方法的确定 7
2.7 纳豆芽孢杆菌发酵条件优化 9
3 结果与讨论 10
3.1 菌落形态 10
3.2 革兰氏染色 11
3.3 生长曲线 11
3.4 酶活测定方法的确定 12
3.5 酶活测定 14
3.6 发酵培养基优化 15
3.7 正交实验 16
3.8 培养基优化后酶活曲线的测定 18
结 论 19
致 谢 20
参考文献 21
1 引言
1.1 研究目的和意义
随着现代科技的发展，物质文明得到了极大的发展，人们生活节奏变快，压力也变得越来越大，再加上人们生活的环境日益恶，各种疾病的发病率大大提高。由血栓引起的心脑血管疾病的发病率日益提高，据统计血栓性疾病的发病率和死亡率居各种疾病之首，对于如何治疗血栓性疾病已成为各国研究的热点。
目前临床上治疗血栓主要是注射链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等纤溶酶原激活剂药物，这些药物通过激活纤溶酶原生成纤溶酶来降解纤维蛋白达到治疗的目的。在实际应用中它们都具有毒性强，副作用大，价格昂贵等局限性，所以开发新型的治疗血栓的药物具有很大意义。
纳豆是一种源自日本的传统食品，经常食用可以防止骨质疏松，促凝血、抗致病菌、延缓衰老、防癌抗癌、调整肠功能。其中的主要的活性成分-纳豆激酶更是具有良好的溶栓特性和安全性，引起了医药学领域的广泛关注。纳豆激酶具有溶栓效果好；来源于食品，无任何毒副作用；分子量小，易被人体消化吸收等优点，作为一种微生物代谢产物，其运用于工业化大规模生产也并非没有可能。是一种很有潜力的新型口服溶栓药物，具有广阔的开发应用前景[1]。
1.2 国内外研究现状
国内外的很多机构及学者对纳豆中的营养成分及活性成分，纳豆的医疗保健功能，纳豆芽孢杆菌的菌种选育等进行了研究，但更多的则是研究纳豆激酶的溶解血栓的作用，其中包括对纳豆激酶的生理生化性质，药效药理，酶活性的测定方法，纳豆激酶的提取纯化方法，以及固体、液体发酵产纳豆激酶的工艺等方面的研究。近年来又对纳豆激酶分子学方面做了不少研究，如：纳豆激酶基因的克隆、表达等[2]。
从1995年国内出现了第一篇有关纳豆和纳豆激酶的报道以来，我国也掀起了对纳豆及纳豆激酶的研究和开发热潮。其中在纳豆菌株的筛选，发酵工艺的优化，纳豆激酶的生理生化，纳豆激酶基因的克隆和表达及产品开发等多方面取得很好的进展，已经从不同菌株中克隆了纳豆激酶的成熟肽基因，实现了在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中的表达，并通过柱层析分离纯化出高纯度的具有溶栓活性的纳豆激酶。
1.3 研究内容和方法
本文主要进行以下研究。
（1）纳豆芽孢杆菌菌株的筛选。从市售燕京纳豆中筛选出纳豆芽孢杆菌菌株。对筛选得到的纳豆芽孢杆菌菌株进行菌种鉴定，确定各纳豆菌株的分类学地位，为纳豆菌生理特征的研究提供菌种基础。
（2）纳豆芽孢杆菌蛋白酶活力的测定及其特性的研究。使用不同的方法对筛得菌株进行酶活的测定，找出一种即快速、又方便、还经济的适合实验室测定溶栓酶活性的方法。
（3）纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶的条件优化。对分离得到的各纳豆芽孢杆菌菌株粗酶液中的纳豆激酶活力进行测定；并在普通发酵培养基的基础上，分别改变培养基的碳源、氮源、无机盐、磷酸盐的种类，考察培养基组成对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶活力的影响，找出液体发酵产纳豆激酶的最优条件，为进一步研究和开发纳豆激酶提供理论和实验数据。
2 实验过程
2.1 材料
实验过程中所用药品如表1所示。
表1 实验过程中所用药品目录
| 品名 | 纯度 | 生产厂家 |
| NaCl | 分析纯 | 上海青析化工科技有限公司 |
| MgSO4 | 分析纯 | 江苏强盛功能化学股份有限公司 |
| CaCl2 | 分析纯 | 江苏强盛功能化学股份有限公司 |
| K2SO4 | 分析纯 | 上海久亿化学试剂有限公司 |
| KCl | 分析纯 | 上海久亿化学试剂有限公司 |
| 蔗糖 | 分析纯 | 江苏强盛功能化学股份有限公司 |
| 可溶性淀粉 | 分析纯 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 麦芽糖 | 分析纯 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 乳糖 | 分析纯 | 上海强顺化学试剂有限公司 |
| 葡萄糖 | 分析纯 | 江苏强盛功能化学股份有限公司 |
| 酵母膏 | 分析纯 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 牛肉膏 | 分析纯 | 天津市大茂化学试剂 |
| 蛋白胨 | 分析纯 | 上海强顺化学试剂有限公司 |
| 尿素 | 分析纯 | 上海久亿化学试剂有限公司 |
| Na2HPO4 | 分析纯 | 上海久亿化学试剂有限公司 |
| NaH2PO4 | 分析纯 | 宿州化学试剂厂 |
| K2HPO4 | 分析纯 | 上海强顺化学试剂有限公司 |
| KH2PO4 | 分析纯 | 上海强顺化学试剂有限公司 |
| NaOH | 分析纯 | 南京化学试剂有限公司 |
| 琼脂条 | 化学试剂 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 脱脂奶粉 | 食品 | 伊利高蛋白脱脂高钙奶粉 |
| 纳豆 | 食品 | 燕京大粒纳豆 |
| 牛血纤维蛋白原 | 优级纯 | Sigma 公司 |
| 凝血酶 | 优级纯 | Sigma 公司 |
| 尿激酶 | 注射用 | 天津生物化学制药有限公司 |
| 琼脂粉 | 生化试剂 | 天津市大茂化学试剂厂 |
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/swgc/24368.html
